type: legislation

text:
 VYKONÁVACIE NARIADENIE KOMISIE (EÚ) .../...
 z 30. 1. 2018,
 ktorým sa mení vykonávacie nariadenie (EÚ) 2016/1240, pokiaľ ide o metódy analýzy a hodnotenia kvality mlieka a mliečnych výrobkov oprávnených na verejnú intervenciu a pomoc na súkromné skladovanie
 EURÓPSKA KOMISIA,
 so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,
 so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) č. 1306/2013 zo 17. decembra 2013 o financovaní, riadení a monitorovaní spoločnej poľnohospodárskej politiky a ktorým sa zrušujú nariadenia Rady (EHS) č. 352/78, (ES) č. 165/94, (ES) č. 2799/98, (ES) č. 814/2000, (ES) č. 1290/2005 a (ES) č. 485/2008
 1
 , a najmä na článok 62 ods. 2 bod i),
 keďže:
 (1)V delegovanom nariadení Komisie (EÚ) 2016/1238
 2
 a vo vykonávacom nariadení Komisie (EÚ) 2016/1240
 3
 sa stanovujú pravidlá týkajúce sa verejnej intervencie a pomoci na súkromné skladovanie. V nariadení Komisie (ES) č. 273/2008
 4
 sa stanovujú metódy, ktoré sa majú použiť na posúdenie toho, či mlieko a mliečne výrobky spĺňajú požiadavky oprávnenosti na verejnú intervenciu a pomoc na súkromné skladovanie stanovené v uvedených nariadeniach.
 (2)Vzhľadom na technický vývoj v metodike používanej na analýzu a hodnotenie kvality mlieka a mliečnych výrobkov by sa mali vykonať podstatné zmeny s cieľom dosiahnuť zjednodušenie a zabezpečiť aktualizované odkazy na normy ISO. V záujme jasnosti a efektívnosti a vzhľadom na rozsah a technický charakter zmien ustanovení nariadenia (ES) č. 273/2008 by sa mali príslušné ustanovenia uvedeného nariadenia začleniť do vykonávacieho nariadenia (EÚ) 2016/1240.
 (3)Aby sa zabezpečilo jednotné dodržiavanie nových noriem a metód vo všetkých členských štátoch, laboratóriám by sa mal poskytnúť dostatočný čas na preskúmanie postupov a uplatnenie aktualizovaných metód.
 (4)Vykonávacie nariadenie (EÚ) 2016/1240 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.
 (5)V záujme právnej istoty by sa nariadenie (ES) č. 273/2008 malo zrušiť.
 (6)Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom Výboru pre spoločnú organizáciu poľnohospodárskych trhov,
 PRIJALA TOTO NARIADENIE:
 Článok 1
 Vykonávacie nariadenie (EÚ) 2016/1240 sa mení takto:
 1.Článok 4 sa mení takto:
 a)Odsek 1 sa mení takto:
 i) písmeno d) sa nahrádza takto:
 „pri masle: v častiach I a Ia prílohy IV k tomuto nariadeniu;“;
 ii) písmeno e) sa nahrádza takto:
 „pri sušenom odstredenom mlieku: v častiach I a Ia prílohy V k tomuto nariadeniu.“;
 b)Odsek 2 sa nahrádza takto:
 „2. Metódy používané na zisťovanie kvality obilnín, masla a sušeného odstredeného mlieka oprávnených na verejnú intervenciu uvedené v prílohách I, IV a V sú metódy stanovené v poslednom znení príslušných európskych, prípadne medzinárodných noriem, platnom najmenej 6 mesiacov pred prvým dňom obdobia verejnej intervencie vymedzeného v článku 12 nariadenia (EÚ) č. 1308/2013.“
 2.Vkladá sa tento článok 60a:
 „Článok 60a
 Osobitné ustanovenia o kontrolách v súvislosti s verejnou intervenciou a pomocou na súkromné skladovanie v prípade mlieka a mliečnych výrobkov
 1. Oprávnenosť mlieka, sušeného odstredeného mlieka a syra na získanie pomoci na súkromné skladovanie sa stanovuje v súlade s metódami stanovenými v prílohách VI, VII a VIII.
 Uvedené metódy sa stanovujú odkazom na posledné znenie príslušných európskych, prípadne medzinárodných noriem, platnom najmenej 6 mesiacov pred prvým dňom obdobia verejnej intervencie vymedzeného v článku 12 nariadenia (EÚ) č. 1308/2013.
 2. Výsledky kontrol vykonaných s použitím metód stanovených v tomto nariadení sa vyhodnocujú v súlade s prílohou IX.“
 3.Prílohy sa menia v súlade s prílohou k tomuto nariadeniu.
 Článok 2
 Nariadenie Komisie (ES) č. 273/2008 sa zrušuje.
 Článok 3
 Toto nariadenie nadobúda účinnosť siedmym dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.
 Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.
 V Bruseli 30. 1. 2018
 Za Komisiu
 predseda
 Jean-Claude JUNCKER
 (1)
 Ú. v. EÚ L 347, 20.12.2013, s. 549.
 (2)
 Delegované nariadenie Komisie (EÚ) 2016/1238 z 18. mája 2016, ktorým sa dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) č. 1308/2013, pokiaľ ide o verejnú intervenciu a pomoc na súkromné skladovanie (Ú. v. EÚ L 206, 30.7.2016, s. 15).
 (3)
 Vykonávacie nariadenie Komisie (EÚ) 2016/1240 z 18. mája 2016, ktorým sa stanovujú pravidlá uplatňovania nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) č. 1308/2013, pokiaľ ide o verejnú intervenciu a pomoc na súkromné skladovanie (Ú. v. EÚ L 206, 30.7.2016, s. 71).
 (4)
 Nariadenie Komisie (ES) č. 273/2008 z 5. marca 2008, ktorým sa ustanovujú podrobné pravidlá uplatňovania nariadenia Rady (ES) č. 1255/1999 týkajúce sa metód analýzy a hodnotenia kvality mlieka a mliečnych výrobkov (Ú. v. EÚ L 88, 29.3.2008, s. 1).
 ---documentbreak---
 SK
 PRÍLOHA
 Prílohy k vykonávaciemu nariadeniu (EÚ) 2016/1240 sa menia takto:
 1. Príloha IV sa mení takto:
 a) Druhý odsek v bode 2 časti I sa nahrádza takto:
 „Každá vzorka sa musí posudzovať individuálne. Opakovaný výber vzorky ani opakované vyhodnocovanie nie je dovolené.“;
 b) Vkladá sa táto časť Ia:
 „Časť Ia
 Metóda analýzy nesoleného masla pre verejnú intervenciu
 Parameter
 Metóda
 Tuk
 1
 ISO 17189 alebo ISO 3727 časť 3
 Voda
 ISO 3727 časť 1
 Beztuková sušina
 ISO 3727 časť 2
 Kyslosť tuku
 ISO 1740
 Peroxidové číslo
 ISO 3976
 Nemliečny tuk
 ISO 17678
 Senzorické vlastnosti
 ISO 22935 časť 2 a 3 a ďalej uvedená tabuľka bodového hodnotenia.
 Tabuľka bodového ohodnotenia
 Vzhľad
 Textúra
 Vôňa a chuť
 Body
 Poznámky
 Body
 Poznámky
 Body
 Poznámky
 5
 veľmi dobrý
 ideálny typ
 najvyššia kvalita
 (rovnomerne suché)
 5
 veľmi dobrá
 ideálny typ
 najvyššia kvalita
 (rovnomerne roztierateľné)
 5
 veľmi dobrá
 ideálny typ
 najvyššia kvalita
 (úplne čistá najjemnejšia aróma)
 4
 dobrý
 (žiadne viditeľné nedostatky)
 4
 dobrá
 (žiadne viditeľné nedostatky)
 4
 dobrá
 (žiadne viditeľné nedostatky)
 1, 2 alebo 3
 akýkoľvek nedostatok
 1, 2 alebo 3
 akýkoľvek nedostatok
 1, 2 alebo 3
 akýkoľvek nedostatok
 “
 2. V prílohe V sa dopĺňa táto časť Ia:
 „Časť Ia
 Metóda analýzy sušeného odstredeného mlieka pre verejnú intervenciu
 Parameter
 Metóda
 Bielkoviny
 ISO 8968 časť 1
 Tuk
 ISO 1736
 Voda
 ISO 5537
 Kyslosť
 ISO 6091
 Laktáty
 ISO 8069
 Test fosfatázy
 ISO 11816 časť 1
 Index nerozpustnosti
 ISO 8156
 Pripálené častice
 2
 ADPI
 Mikroorganizmy
 ISO 4833 časť 1
 Cmar
 dodatok I
 Syridlová srvátka
 3
 dodatky II a III
 Kyslá srvátka
 4
 ISO 8069 alebo kontroly na mieste
 Zmyslové kontroly
 5
 ISO 22935 časť 2 a 3
 Dodatok I
 SUŠENÉ ODSTREDENÉ MLIEKO: KVANTITATÍVNE STANOVENIE FOSFATIDYLSERÍNU A FOSFATIDYLETANOLAMÍNU
 Metóda: HPLC s reverznou fázou
 1.ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA
 Táto metóda opisuje postup kvantitatívneho stanovenia obsahu fosfatidylserínu (PS) a fosfatidyletanolamínu (PE) v sušenom odstredenom mlieku (OSM) a je vhodná na zisťovanie pevného cmaru v OSM.
 2.VYMEDZENIE
 Obsah PS +PE: hmotnostná frakcia látky stanovená pomocou uvedeného postupu. Výsledok sa vyjadruje v miligramoch dipalmitoyl-fosfatidylethanolamínu (PEDP) na 100 g prášku.
 3.PRINCÍP METÓDY
 Extrakcia aminofosfolipidov metanolom z obnoveného sušeného mlieka. Stanovenie obsahu PS a PE ako derivátov o-ftalaldehydu (OPA) pomocou HPLC s reverznou fázou (RP) a fluorescenčnou detekciou. Kvantifikácia obsahu PS a PE v testovanej vzorke porovnaním so štandardnou vzorkou obsahujúcou známe množstvo PEDP.
 4.REAGENTY
 Používajú sa len reagenty uznanej analytickej kvality. Používa sa destilovaná voda alebo voda s prinajmenšom ekvivalentnou čistotou, ak nie je uvedené inak.
 4.1.
 Štandardný materiál: PEDP s čistotou najmenej 99 %
 Poznámka: štandardný materiál sa skladuje pri teplote –18 °C.
 4.2.
 Reagenty na prípravu štandardnej a testovanej vzorky
 4.2.1.
 Metanol kvality HPLC
 4.2.2.
 Chloroform kvality HPLC
 4.2.3.
 2-(indol-3-yl)etylamín
 4.3.
 Reagenty pre derivatizáciu o-ftalaldehydu
 4.3.1.
 Hydroxid sodný, vodný roztok 12 M
 4.3.2.
 Kyselina trihydrogenboritá, vodný roztok 0,4 M upravený na pH 10 hydroxidom sodným (4.3.1)
 4.3.3.
 2-sulfanyletán-1-ol
 4.3.4.
 o-ftalaldehyd (OPA)
 4.4.
 Elučné rozpúšťadlá HPLC
 4.4.1.
 Eluenty sa pripravujú použitím reagentov HPLC kvality.
 4.4.2.
 Voda HPLC kvality
 4.4.3.
 Metanol fluorometricky testovanej čistoty
 4.4.4.
 Tetrahydrofurán
 4.4.5.
 Dihydrogénfosforečnan sodný
 4.4.6.
 Octan sodný
 4.4.7.
 Kyselina octová
 5.PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
 5.1.
 Analytické váhy schopné vážiť na najbližší 1 mg s presnosťou 0,1 mg
 5.2.
 Kadičky s objemom 25 a 100 ml
 5.3.
 Pipety umožňujúce dávkovať 1 a 10 ml kvapaliny
 5.4.
 Magnetické miešadlo
 5.5.
 Delené pipety, umožňujúce dávkovať 0,2, 0,5 a 5 ml kvapaliny
 5.6.
 Odmerné banky s objemom 10, 50 a 100 ml
 5.7.
 Striekačky s objemom 20 a 100 μl
 5.8.
 Ultrazvukový kúpeľ
 5.9.
 Odstredivka schopná prevádzky pri 27 000 × g
 5.10.
 Sklenené skúmavky s objemom približne 5 ml
 5.11.
 Odmerný valec s objemom 25 ml
 5.12.
 pH-meter s presnosťou na 0,1 pH jednotiek
 5.13.
 Vybavenie pre HPLC
 5.13.1.
 Gradientový čerpací systém nastaviteľný na 1 ml/ min pri 200 bar
 5.13.2.
 Automatický dávkovač vzoriek s možnosťou derivatizácie
 5.13.3.
 Kolónový termostat schopný udržiavať teplotu kolóny na 30 °C ± 1 °C
 5.13.4.
 Fluorescenčný detektor nastavený na vlnovú dĺžku excitácie 330 nm a vlnovú dĺžku emisie 440 nm
 5.13.5.
 Integrátor alebo program na spracovanie dát umožňujúci meranie plochy píku
 5.13.6.
 Kolóna LiChrospher® – 100 (250 × 4,6 mm) alebo ekvivalentná kolóna naplnená oktadecylsilánom (C 18), veľkosť čiastočiek 5 μm (ODS).
 6.ODBER VZORIEK
 Odber vzoriek sa vykoná v súlade s normou ISO 707.
 7.POSTUP
 7.1.
 Príprava interného štandardného roztoku
 7.1.1.
 Do 100 ml odmernej banky (5.6) odvážte 30,0 ± 0,1 mg 2-(indol-3-yl)etylamínu (4.2.3) a po značku doplňte metanolom (4.2.1)
 7.1.2.
 Do 10 ml odmernej banky (5.6) pipetujte 1 ml (5.3) tohto roztoku a doplňte po značku metanolom (4.2.1) aby ste získali koncentráciu 0,15 mM 2-(indol-3-yl)etylamínu
 7.2.
 Príprava roztoku testovanej vzorky
 7.2.1.
 Do 25 ml kadičky (5.2) odvážte 1,000 ± 0,001 g vzorky OSM. Pri 40 °C ± 1 °C pipetou (5.3) pridajte 10 ml destilovanej vody a premiešajte magnetickým miešadlom (5.4) počas 30 minút, aby sa rozpustili všetky hrudky
 7.2.2.
 Do 10 ml odmernej banky (5.6) napipetujte 0,2 ml (5.5) obnoveného mlieka, pomocou striekačky (5.7) pridajte 100 μl 0,15 mM roztoku 2-(indol-3-yl)etylamínu (7.1) a doplňte metanolom (4.2.1). Opatrne premiešajte prevracaním a vložte do ultrazvukového kúpeľa (5.8) na 15 minút
 7.2.3.
 Odstreďte (5.9) pri 27 000 × g počas 10 minút a supernatant zachyťte do sklenenej skúmavky (5.10)
 Poznámka: Roztok testovanej vzorky by sa do vykonania analýzy HPLC mal skladovať pri teplote 4 °C
 7.3.
 Príprava externého štandardného roztoku
 7.3.1.
 Do 50 ml odmernej banky (5.6) odvážte 55,4 mg PEDP (4.1) a pomocou odmerného valca (5.11) pridajte približne 25 ml chloroformu (4.2.2). Uzavretú banku zohrejte na 50 °C ± 1 °C a opatrne miešajte, pokým sa PEDP nerozpustí. Banku ochlaďte na 20 °C, doplňte metanolom (4.2.1) a premiešajte prevracaním
 7.3.2.
 Napipetujte (5.3) 1 ml tohto roztoku do 100 ml odmernej banky (5.6) a doplňte metanolom (4.2.1) po značku. Napipetujte 1 ml (5.3) tohto roztoku do 10 ml odmernej banky (5.6), pridajte 100 μl (5.7) 0,15 mM roztoku 2-(indol-3-yl)etylamínu (7.1) a objem doplňte metanolom (4.2.1). Premiešajte obracaním
 Poznámka: Roztok referenčnej vzorky by sa do vykonania analýzy HPLC mal skladovať pri teplote 4 °C
 7.4.
 Príprava derivatizačného činidla
 Do 10 ml odmernej banky (5.6) odvážte 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4), pridajte 0,5 ml (5.5) metanolu (4.2.1) a opatrne miešajte, pokým sa OPA nerozpustí. Po značku doplňte roztokom kyseliny trihydrogenbóritej (4.3.2) a striekačkou (5.7) pridajte 20 μl 2-sulfanyletán-1-olu (4.3.3)
 Poznámka: Derivatizačné činidlo by sa malo skladovať pri teplote 4 °C v tmavej fľaši a je stabilné jeden týždeň.
 7.5.
 Analýza HPLC
 7.5.1.
 Elučné roztoky (4.4)
 Roztok A: roztok 0,3 mM dihydrofosforečnanu sodného a roztoku 3 mM octanu sodného (upraveného na pH 6,5 ± 0,1 kyselinou octovou): metanol: tetrahydrofurán = 558:440:2 (v/v/v)
 Roztok B: metanol
 7.5.2.
 Navrhované hodnoty elučného gradientu:
 Čas (minúty)
 Roztok A (%)
 Roztok B (%)
 Prietok (ml/min)
 Počiatočný
 40
 60
 0
 0,1
 40
 60
 0,1
 5,0
 40
 60
 0,1
 6,0
 40
 60
 1,0
 6,5
 40
 60
 1,0
 9,0
 36
 64
 1,0
 10,0
 20
 80
 1,0
 11,5
 16
 84
 1,0
 12,0
 16
 84
 1,0
 16,0
 10
 90
 1,0
 19,0
 0
 100
 1,0
 20,0
 0
 100
 1,0
 21,0
 40
 60
 1,0
 29,0
 40
 60
 1,0
 30,0
 40
 60
 0
 Poznámka: S cieľom dosiahnuť rozlíšenie znázornené na obrázku 1 možno bude potrebné mierne prispôsobiť elučný gradient.
 Teplota kolóny: 30 °C.
 7.5.3.
 Objem nástreku: 50 μl derivatizačného činidla a 50 μl roztoku vzorky
 7.5.4.
 Kondiciovanie kolóny
 Pri dennom spúšťaní systému prepláchnite kolónu 100 % rozpúšťadlom B počas 15 minút, potom nastavte pomer A:B = 40:60 a premývajte pri 1 ml/min počas 15 minút. Uskutočnite slepé meranie nástrekom metanolu (4.2.1).
 Poznámka: Pred dlhodobým uskladnením kolónu prepláchnite zmesou metanolu a chloroformu v pomere 80:20 (obj.) počas 30 minút.
 7.5.5.
 Stanovenie obsahu PS + PE v testovanej vzorke
 7.5.6.
 Pri meraní sekvencie chromatografických analýz dodržiavajte rovnaký čas pre každý nástrek, aby sa dosiahli konštantné retenčné časy. Po každej 5 – 10 testovanej vzorke injektujte externý štandardný roztok (7.3) na výpočet reakčného faktora
 Poznámka: Kolónu je potrebné po každom 20 – 25. nástreku vyčistiť prepláchnutím 100 % rozpúšťadla B (7.5.1.) najmenej počas 30 minút.
 7.6.
 Spôsob integrácie
 7.6.1.
 Pík PEDP
 PEDP sa eluuje ako jeden pík. Plochu píku stanovte integráciou od spodnej časti pred píkom až k spodnej časti za píkom (valley-to-valley).
 7.6.2.
 Pík 2-(indol-3-yl)etylamínu
 2-(indol-3-yl)etylamín sa eluuje ako jeden pík (obrázok 1). Plochu píku stanovte integráciou od spodnej časti pred píkom až k spodnej časti za píkom (valley-to-valley).
 7.6.3.
 Skupiny píkov PS a PE
 Za opísaných podmienok (obrázok 1) sa PS eluuje ako dva hlavné čiastočne nerozlíšené píky, ktorým predchádza jeden menší pík. PE sa eluuje ako tri hlavné čiastočne nerozlíšené píky. Stanovte celkovú plochu každého zhluku píkov nastavením základnej čiary tak, ako je znázornené na obrázku 1.
 8.VÝPOČET A VYJADRENIE VÝSLEDKOV
 Obsah PS a PE v testovanej vzorke sa vypočíta takto:
 C = 55,36 × [(A2)/(A1)] × [(T1)/(T2)]
 kde:
 C = obsah PS alebo PE (mg/100 g prášku) v testovanej vzorke
 A 1 = plocha píku PEDP roztoku štandardnej vzorky (7.3)
 A 2 = plocha píku PS alebo PE roztoku testovanej vzorky (7.2)
 T 1 = plocha píku 2-(indol-3-yl)etylamínu roztoku štandardnej vzorky (7.3)
 T 2 = plocha píku 2-(indol-3-yl)etylamínu roztoku testovanej vzorky (7.2)
 9.PRESNOSŤ METÓDY
 Poznámka: Hodnoty pre opakovateľnosť boli vypočítané podľa normy IDF
 6
 .
 9.1.
 Opakovateľnosť
 Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti, ktorá vyjadruje variabilitu nezávislých výsledkov analýz získaných rovnakým analytikom pri použití rovnakých prístrojov v rovnakých podmienkach a na rovnakej testovanej vzorke za krátky časový interval, nesmie presiahnuť relatívnu hodnotu 2 %. Ak sa dva výsledky získajú za týchto podmienok, relatívna odchýlka medzi týmito dvoma výsledkami nesmie byť väčšia ako 6 % aritmetického priemeru výsledkov.
 9.2.
 Reprodukovateľnosť
 Ak dva výsledky získajú analytici analýzou tej istej testovanej vzorky v dvoch rôznych laboratóriách použitím rôznych prístrojov a v rôznych podmienkach, relatívna odchýlka medzi týmito dvoma výsledkami nesmie byť väčšia ako 11 % aritmetického priemeru výsledkov.
 10.ODKAZY
 10.1.
 Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M.: Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).
 Obrázok 1
 HPLC záznam OPA derivátov fosfatidylserínu (PS) a fosfatidyletanolamínu (PE) v metanolovom extrakte obnoveného sušeného odstredeného mlieka. Znázornený je spôsob integrácie pre píky PS, PE a tryptamínu (interný štandard)
 Fluorescencia (ľubovoľné jednotky)
 Dodatok II
 ZISŤOVANIE SYRIDLOVEJ SRVÁTKY V SUŠENOM ODSTREDENOM MLIEKU URČENOM NA VEREJNÉ SKLADOVANIE STANOVENÍM OBSAHU KAZEÍNMAKROPEPTIDOV VYSOKOÚČINNOU KVAPALINOVOU CHROMATOGRAFIOU (HPLC)
 1.ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA
 Táto metóda umožňuje zisťovanie prítomnosti syridlovej srvátky v sušenom odstredenom mlieku určenom na verejné skladovanie stanovením obsahu kazeínmakropeptidov.
 2.ODKAZ
 Medzinárodná norma ISO 707 – Mlieko a mliečne výrobky – návod na odber vzoriek.
 3.DEFINÍCIA
 Obsah pevnej syridlovej srvátky je definovaný ako hmotnostné percento obsahu kazeínmakropeptidov stanovených uvedeným postupom.
 4.PRINCÍP
 –Obnovenie sušeného odstredeného mlieka, odstránenie tuku a bielkovín kyselinou trichlóroctovou s následným odstredením alebo filtráciou.
 –Stanovenie množstva kazeínmakropeptidov (CMP) v supernatante vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC).
 –Vyhodnotenie výsledku sa získa porovnaním vzoriek so štandardnými vzorkami, obsahujúcimi sušené odstredené mlieko s prídavkom alebo bez prídavku známeho percentuálneho podielu sušenej srvátky.
 5.REAGENTY
 Používajú sa len reagenty uznanej analytickej kvality. Používa sa destilovaná voda alebo voda s prinajmenšom ekvivalentnou čistotou.
 5.1.
 Roztok kyseliny trichlóroctovej
 Rozrieďte 240 g kyseliny trichlóroctovej (CCl3COOH) vo vode a doplňte do 1000 ml. Roztok by mal byť čistý a bezfarebný.
 5.2.
 Elučný roztok, pH 6,0
 V približne 700 ml vody rozpusťte 1,74 g hydrogénfosforečnanu draselného (K2HPO4), 12,37 g dihydrogénfosofrečnanu draselného (KH2PO4) a 21,41 g síranu sodného (Na2SO4). Podľa potreby upravte pH na hodnotu 6,0 použitím roztoku kyseliny fosforečnej alebo hydroxidu draselného.
 Doplňte objem vodou na 1 000 ml a zhomogenizujte.
 Poznámka:
 Zloženie eluentu možno upraviť tak, aby zodpovedalo osvedčeniu noriem alebo odporúčaniam výrobcu plniacich materiálov do kolón.
 Elučný roztok pred použitím prefiltrujte cez membránový filter s pórmi s priemerom 0,45 μm.
 5.3.
 Premývací roztok
 Jeden diel acetonitrilu (CH3CN) zmiešajte s deviatimi dielmi vody. Zmes pred použitím prefiltrujte cez membránový filter s priemerom pórov 0,45 μm.
 Poznámka:
 Použiť sa môže akýkoľvek iný premývací roztok s baktericídnym účinkom, ktorý neovplyvňuje rozlišovaciu schopnosť kolóny.
 5.4.
 Štandardné vzorky
 5.4.1.
 Sušené odstredené mlieko vyhovujúce požiadavkám tohto nariadenia (t. j. [0])
 5.4.2.
 To isté sušené odstredené mlieko falšované pridaním 5 % (m/m) sušenej srvátky syridlového typu štandardného zloženia (t. j. [5])
 6.PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
 6.1.
 Analytické váhy
 6.2.
 Voliteľné: odstredivka schopná dosiahnuť odstredivú silu 2 200 g, vybavená uzavierateľnými odstreďovacími skúmavkami s objemom približne 50 ml
 6.3.
 Mechanická trepačka
 6.4.
 Magnetické miešadlo
 6.5.
 Sklenené lieviky s priemerom približne 7 cm
 6.6.
 Filtračné papiere so strednou filtráciou, s priemerom približne 12,5 cm
 6.7.
 Sklenené zariadenie na filtráciu s membránovým filtrom s priemerom pórov 0,45 μm
 6.8.
 Delené pipety umožňujúce dávkovať 10 ml kvapaliny (ISO 648, trieda A, alebo ISO/R 835) alebo dávkovací systém schopný dávkovať 10,0 ml kvapaliny za dve minúty
 6.9.
 Dávkovací systém schopný dávkovať 20,0 ml vody s teplotou okolo 50 °C
 6.10.
 Termostatický vodný kúpeľ nastavený na 25 ± 0,5 °C
 6.11.
 Zariadenie HPLC pozostávajúce z:
 6.11.1.
 Čerpadla
 6.11.2.
 Injektora, ručného alebo automatického s kapacitou 15 až 30 μl
 6.11.3.
 Dvoch kolón TSK 2 000-SW v sérii (dĺžka 30 cm, vnútorný priemer 0,75 cm) alebo ekvivalentných kolón (napr. jednej TSK 2 000-SWxl, jednej Agilent Technologies Zorbax 250) a predkolóny (3 cm × 0,3 cm) plnených I 125 alebo materiálom s ekvivalentnou účinnosťou
 6.11.4.
 Kolónového termostatu nastaveného na 35 ± 1 °C
 6.11.5.
 UV detektora s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou, ktorý umožňuje merania pri 205 nm s citlivosťou 0,008 Å
 6.11.6.
 Integrátora na meranie výšky píkov
 Poznámka:Práca s kolónami ponechanými pri izbovej teplote je možná, avšak ich rozlišovacia schopnosť je o niečo nižšia. V takom prípade by výkyvy teploty mali byť menšie než 5 °C v každom rozpätí analýzy.
 7.ODBER VZORIEK
 7.1.
 Vzorky sa musia odoberať v súlade s postupom stanoveným v medzinárodnej norme ISO 707. Členské štáty však môžu použiť aj inú metódu odberu vzoriek za predpokladu, že je v súlade so zásadami vyššie uvedenej normy
 7.2.
 Vzorku skladujte v podmienkach vylučujúcich akékoľvek znehodnotenie alebo zmenu zloženia
 8.POSTUP
 8.1.
 Príprava testovanej vzorky
 Sušené mlieko vložte do nádoby s objemom rovnajúcim sa približne dvojnásobku jeho objemu, ktorá je vybavená vzduchotesným vekom. Nádobu ihneď zatvorte. Sušené mlieko dobre premiešajte opakovaným prevracaním nádoby.
 8.2.
 Testovaná dávka
 Odvážte 2,000 ± 0,001 g testovanej vzorky do odstreďovacej skúmavky (6.2) alebo vhodnej banky s uzáverom (50 ml).
 8.3.
 Odstránenie tukov a bielkovín
 8.3.1.
 Do dávky testovanej vzorky pridajte 20,0 ml teplej vody (50 °C). Prášok rozpusťte pretrepaním počas piatich minút pomocou mechanickej trepačky (6.3). Skúmavku vložte do vodného kúpeľa (6.10) a nechajte ustáliť na 25 °C
 8.3.2.
 V priebehu dvoch minút pridajte 10,0 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (5.1), ktorá má teplotu okolo 25 °C, za súčasného intenzívneho miešania magnetickým miešadlom (6.4). Skúmavku umiestnite na 60 minút do vodného kúpeľa (6.10)
 8.3.3.
 Vzorku odstreďte (6.2) počas 10 minút pri 2 200 g alebo prefiltrujte cez papier (6.6) a prvých 5 ml filtrátu vylejte
 8.4.
 Chromatografické stanovenie
 8.4.1.
 Do HPLC prístroja (6.11) nastaveného na prietok 1,0 ml elučného roztoku (5.2) za minútu injektujte 15 až 30 μl presne odmeraného supernatantu alebo filtrátu (8.3.3)
 Poznámka 1. Možno použiť aj iný prietok v závislosti od vnútorného priemeru použitých kolón alebo pokynov výrobcu kolóny.
 Poznámka 2. Kolóny opláchnite vodou počas každého prerušenia. Nikdy v nich nenechávajte elučný roztok (5.2).
 Pred každým prerušením dlhším ako 24 hodín prepláchnite kolóny vodou, potom ich premyte roztokom (5.3.) najmenej tri hodiny pri prietoku 0,2 ml za minútu.
 8.4.2.
 Výsledky chromatografickej analýzy testovanej vzorky [E] sa získajú vo forme chromatogramu, v ktorom je každý pík identifikovaný podľa svojho retenčného času RT nasledovne:
 Pík II:
 Druhý pík chromatogramu s RT približne 12,5 minúty.
 Pík III:
 Tretí pík chromatogramu zodpovedajúci CMP s RT 15,5 minúty.
 Výber kolóny, resp. kolón môže podstatne ovplyvniť retenčné časy jednotlivých píkov.
 Integrátor (6.11.6) automaticky vypočíta plochu A každého píku:
 AII:
 plocha píku II
 AIII:
 plocha píku III
 Pred kvantitatívnou interpretáciou je dôležité preskúmať vzhľad každého chromatogramu aby sa zistili akékoľvek abnormality zapríčinené buď poruchou prístroja alebo kolón, alebo pôvodom a povahou analyzovanej vzorky.
 V prípade pochybností analýzu zopakujte.
 8.5.
 Kalibrácia
 8.5.1.
 Pri štandardných vzorkách (5.4) použite presne postup opísaný v bodoch 8.2 až 8.4.2
 Použite čerstvo pripravené roztoky, pretože CMP v 8 % trichlóroctovom prostredí degraduje. Strata sa odhaduje na 0,2 % za hodinu pri 30 °C.
 8.5.2.
 Pred chromatografickým stanovením vzoriek kondicionujte kolóny opakovanou injektážou štandardnej vzorky (5.4.2) v roztoku (8.5.1), pokým sa plocha a retenčný čas píku zodpovedajúceho CMP neustália na konštantných hodnotách
 8.5.3.
 Responzné faktory R stanovte injektovaním rovnakých objemov filtrátov (8.5.1), aké sa použili pri vzorkách
 9.VYJADRENIE VÝSLEDKOV
 9.1.
 Metóda výpočtu a vzorce
 9.1.1.
 Výpočet responzných faktorov R:
 Pík II:
 RII =100/(AII[0])
 kde:
 RII
 =
 responzný faktor píku II
 AII [0]
 =
 plochy píkov II štandardných vzoriek [0] získaných v bode 8.5.3
 Pík III:
 RIII = W/(AIII[5] -AIII[0])
 kde:
 RIII
 =
 responzný faktor píku III
 AIII [0] and AIII [5]
 =
 plochy píku III v štandardných vzorkách [0] a [5] získaných v bode 8.5.3
 W
 =
 množstvo srvátky v štandardnej vzorke [5], t. j. 5
 9.1.2.
 Výpočet relatívnej plochy píkov vo vzorke [E]
 SII[E] = RII × AII[E]
 SIII[E] = RIII × AIII[E]
 SIV[E] = RIV × AIV[E]
 kde:
 SII [E], SIII [E], SIV [E]
 =
 relatívne plochy píkov II, III a IV vo vzorke [E],
 AII [E], AIII [E]
 =
 plochy píkov II a III vo vzorke [E] získané podľa bodu 8.4.2,
 RII, RIII
 =
 responzný faktor vypočítaný podľa bodu 9.1.1
 9.1.3.
 Výpočet relatívneho retenčného času píku III vo vzorke [E] RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])
 kde:
 RRTIII [E]
 =
 relatívny retenčný čas píku III vo vzorke [E],
 RTIII [E]
 =
 retenčný čas píku III vo vzorke [E] získaný v bode 8.4.2,
 RTIII [5]
 =
 retenčný čas píku III kontrolnej vzorky [5] získaný v bode 8.5.3.
 9.1.4.
 Pokusmi sa preukázalo, že medzi relatívnym retenčným časom píku III, t. j. RRTIII [E], a percentuálnym podielom sušenej srvátky pridanej v množstve do 10 % je lineárna závislosť
 –RRTIII [E] je < 1,000, ak je obsah srvátky > 5 %,
 –RRTIII [E] je ≥ 1,000, ak je obsah srvátky ≤ 5 %,
 Povolená neistota pre hodnoty RRTIII je ±0,002.
 Hodnota RRTIII [0] sa zvyčajne mierne odchyľuje od 1,034. V závislosti od stavu kolón sa môže táto hodnota približovať k 1,000, ale vždy musí byť vyššia.
 9.2. Výpočet percentuálneho podielu sušenej syridlovej srvátky vo vzorke
 W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)]
 kde:
 W
 =
 hmotnostné percento syridlovej srvátky vo vzorke [E];
 SIII [E]
 =
 relatívna plocha píku III testovanej vzorky [E] získanej podľa bodu 9.1.2;
 1,3
 =
 predstavuje relatívnu priemernú plochu píku III vyjadrenú v gramoch syridlovej srvátky na 100 g stanovenú v nefalšovanom sušenom odstredenom mlieku rôzneho pôvodu. Toto číslo bolo získané experimentálne;
 SIII [0]
 =
 predstavuje relatívnu plochu píku III, ktorá sa rovná RIII × AIII [0]. Tieto hodnoty sa získajú v bodoch 9.1.1 a 8.5.3;
 (SIII [0] – 0,9)
 =
 predstavuje korekciu, ktorú treba vykonať na relatívnej priemernej ploche 1,3, keď SIII [0] sa nerovná 0,9. Experimentálne sa relatívna priemerná plocha píku III kontrolnej vzorky [0] rovná 0,9.
 9.3.
 Presnosť postupu
 9.3.1.
 Opakovateľnosť
 Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených naraz alebo rýchlo po sebe rovnakým analytikom s použitím rovnakých prístrojov na identickom testovanom materiáli nesmie presiahnuť 0,2 % m/m.
 9.3.2.
 Reprodukovateľnosť
 Rozdiel medzi dvoma osobitnými a nezávislými výsledkami, získanými v dvoch rôznych laboratóriách na identickom testovanom materiáli nesmie presiahnuť 0,4 % m/m.
 9.4.
 Interpretácia
 9.4.1.
 Neprítomnosť srvátky sa predpokladá, ak relatívna plocha píku III, SIII [E], vyjadrená v gramoch syridlovej srvátky na 100 g výrobku, je ≤ 2,0 + (SIII [0] – 0,9),
 kde
 2,0
 je maximálna povolená hodnota relatívnej plochy píku III s prihliadnutím na relatívnu priemernú plochu píku III, t. j. 1,3, neistotu spôsobenú variáciami v zložení sušeného odstredeného mlieka a reprodukovateľnosť metódy (9.3.2),
 (SIII [0] — 0,9)
 je korekcia, ktorú treba vykonať, ak je plocha SIII [0] iná než 0,9 (pozri bod 9.2)
 9.4.2.
 Ak je relatívna plocha píku III, SIII [E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) a relatívna plocha píku II, SII [E] ≤ 160, obsah syridlovej srvátky stanovte podľa bodu 9.2.
 9.4.3.
 Ak je relatívna plocha píku III, SIII [E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) a relatívna plocha píku II, SII [E] ≤ 160, stanovte celkový obsah bielkovín (P %); následne preskúmajte grafy 1 a 2.
 9.4.4.
 Údaje získané po analýze vzoriek nefalšovaného sušeného odstredeného mlieka s vysokým celkovým obsahom bielkovín sú zhrnuté v grafoch 1 a 2.
 Neprerušovaná čiara predstavuje lineárnu regresiu, ktorej koeficienty sú vypočítané metódou najmenších štvorcov.
 Prerušovaná čiara stanovuje horný limit relatívnej plochy píku III, a to s pravdepodobnosťou, že nebude prekročená v 90 % prípadov.
 Rovnice pre prerušované čiary v grafoch 1 a 2 sú:
 SIII = 0,376 P % – 10,7
 (graf 1),
 SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93
 (graf 2),
 kde:
 SIII
 je relatívna plocha píku III, vypočítaná buď podľa celkového obsahu bielkovín, alebo podľa relatívnej plochy píku SII [E],
 P %
 je celkový obsah bielkovín vyjadrený v hmotnostných %,
 SII [E]
 je relatívna plocha vzorky vypočítaná podľa bodu 9.1.2.
 Tieto rovnice sú ekvivalentné s hodnotou 1,3 uvedenou v bode 9.2.
 Rozdiel (T1 a T2) medzi zistenou relatívnou plochou SIII[E] a relatívnou plochou SIII sa vyjadruje prostredníctvom nasledovného vzorca: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% - 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]
 9.4.3.2.
 Ak T1 a/alebo T2
 sú rovné alebo menšie ako nula, prítomnosť syridlovej srvátky nemožno stanoviť
 Ak T1 a T2
 sú vyššie ako nula, syridlová srvátka je prítomná.
 Obsah syridlovej srvátky sa počíta podľa tohto vzorca: W = T2 + 0,91
 kde:
 0,91 je vzdialenosť na vertikálnej osi medzi neprerušovanou a prerušovanou čiarou.
 “
 Dodatok III
 STANOVENIE PEVNEJ SYRIDLOVEJ SRVÁTKY V SUŠENOM ODSTREDENOM MLIEKU
 1.ÚČEL: ZISTENIE PRÍDAVKU PEVNEJ SYRIDLOVEJ SRVÁTKY DO SUŠENÉHO ODSTREDENÉHO MLIEKA
 2.ODKAZY: MEDZINÁRODNÁ NORMA ISO 707
 3.DEFINÍCIA
 Obsah sušiny syridlovej srvátky sa definuje ako hmotnostný zlomok stanovený obsahom kazeínmakropeptidov podľa uvedeného postupu.
 4.PRINCÍP
 Vzorky sa analyzujú na kazeínmakropeptid A metódou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s reverznou fázou. Vyhodnotenie výsledku sa získa porovnaním vzoriek so štandardnými vzorkami, obsahujúcimi sušené odstredené mlieko s prídavkom alebo bez prídavku známeho percentuálneho podielu sušenej srvátky.
 Výsledky vyššie ako 1 % (m/m) dokazujú prítomnosť pevnej syridlovej srvátky.
 5.REAGENTY
 Používajú sa len reagenty uznanej analytickej kvality. Používa sa destilovaná voda alebo voda s prinajmenšom ekvivalentnou čistotou. Acetonitril by mal byť spektroskopickej alebo HPLC kvality.
 5.1.
 Roztok kyseliny trichlóroctovej
 Rozrieďte 240 g kyseliny trichlóroctovej (CCl3COOH) vo vode a doplňte do 1000 ml. Roztok by mal byť čistý a bezfarebný.
 5.2.
 Eluenty A a B
 Eluent A: do 1 000 ml odmernej banky nadávkujte 150 ml acetronitrilu (CH3CN), 20 ml propán-2-olu (CH3CHOHCH3) a 1 ml kyseliny trifluóroctovej (TFA, CF3COOH). Doplňte vodou na 1 000 ml.
 Eluent B: do 1 000 ml odmernej banky nadávkujte 550 ml acetonitrilu, 20 ml propán-2-olu a 1 ml TFA. Doplňte vodou na 1 000 ml. Elučný roztok pred použitím prefiltrujte cez membránový filter s pórmi s priemerom 0,45 μm.
 5.3.
 Uchovávanie kolóny
 Po analýzach sa kolóna prepláchne eluentom B (gradientom) a následne sa prepláchne acetonitrilom (gradientom počas 30 minút). Kolóna sa skladuje v acetonitrile.
 5.4.
 Štandardné vzorky
 5.4.1.
 Sušené odstredené mlieko spĺňajúce požiadavky pre verejné skladovanie (t. j. [0]).
 5.4.2.
 To isté sušené odstredené mlieko falšované pridaním 5 % (m/m) sušenej srvátky syridlového typu štandardného zloženia (t. j. [5])
 5.4.3.
 To isté sušené odstredené mlieko falšované pridaním 50 % (m/m) sušenej srvátky syridlového typu štandardného zloženia (t. j. [50])
 6.PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
 6.1.
 Analytické váhy
 6.2.
 Voliteľné: odstredivka schopná dosiahnuť odstredivú silu 2 200 g, vybavená uzavierateľnými odstreďovacími skúmavkami s objemom približne 50 ml
 6.3.
 Mechanická trepačka
 6.4.
 Magnetické miešadlo
 6.5.
 Sklenené lieviky s priemerom približne 7 cm
 6.6.
 Filtračné papiere so strednou filtráciou, s priemerom približne 12,5 cm
 6.7.
 Sklenené zariadenie na filtráciu s membránovým filtrom s priemerom pórov 0,45 μm
 6.8.
 Delené pipety, umožňujúce dávkovať 10 ml kvapaliny (ISO 648, trieda A alebo ISO/R 835) alebo dávkovací systém schopný dávkovať 10,0 ml kvapaliny za dve minúty
 6.9.
 Dávkovací systém schopný dávkovať 20,0 ml vody o teplote okolo 50 °C
 6.10.
 Termostatický vodný kúpeľ nastavený na 25 ± 0,5 °C
 6.11.
 Zariadenie HPLC pozostávajúce z:
 6.11.1.
 Binárneho gradientového čerpacieho systému
 6.11.2.
 Automatického alebo manuálneho injektora s kapacitou 100 μl
 6.11.3.
 Kolóny Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (dĺžka 25 cm, vnútorný priemer 0,46 cm) alebo ekvivalentnej kolóny s reverznou fázou na báze silikagélu, s veľkými pórmi
 6.11.4.
 Kolónového termostatu nastaveného na 35 ± 1 °C
 6.11.5.
 UV detektora s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou, umožňujúceho merania pri 210 nm (v prípade potreby sa môže použiť vyššia vlnová dĺžka do 220 nm), s citlivosťou 0,02 Å.
 6.11.6.
 Integrátora s možnosťou nastaviť integráciu na obvyklú základnú čiaru alebo integráciu od spodnej časti pred píkom až k spodnej časti za píkom (valley-to-valley).
 Poznámka: Práca s kolónou pri izbovej teplote je možná za predpokladu, že teplotné výkyvy nie sú väčšie ako 1 °C, v opačnom prípade dochádza k príliš veľkým odchýlkam retenčného času CMPA.
 7.ODBER VZORIEK
 7.1.
 Vzorky sa odoberajú v súlade s postupom stanoveným v medzinárodnej norme ISO 707. Členské štáty však môžu použiť aj inú metódu odberu vzoriek za predpokladu, že je v súlade so zásadami uvedenej normy.
 7.2.
 Vzorku skladujte v podmienkach vylučujúcich akékoľvek znehodnotenie alebo zmenu zloženia.
 8.POSTUP
 8.1.
 Príprava testovanej vzorky
 Sušené mlieko vložte do nádoby s objemom rovnajúcim sa približne dvojnásobku jeho objemu, ktorá je vybavená vzduchotesným vekom. Nádobu ihneď zatvorte. Sušené mlieko dobre premiešajte opakovaným prevracaním nádoby.
 8.2.
 Testovaná dávka
 Do odstreďovacej skúmavky (6.2) alebo vhodnej banky s uzáverom (50 ml) odvážte 2,00 ± 0 001 g testovanej vzorky.
 Poznámka: V prípade zmesí odvážte také množstvo testovanej vzorky, aby odtučnená dávka vzorky zodpovedala 2,00 g.
 8.3.
 Odstránenie tukov a bielkovín
 8.3.1.
 Do dávky testovanej vzorky pridajte 20,0 ml teplej vody (50 °C). Prášok rozpusťte pretrepaním pomocou mechanickej trepačky počas piatich minút (6.3.). Skúmavku vložte do vodného kúpeľa (6.10) a nechajte ustáliť na 25 °C.
 8.3.2.
 V priebehu dvoch minút plynule pridávajte 10 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej s teplotou asi 25 °C (5.1) za súčasného intenzívneho miešania magnetickým miešadlom (6.4). Skúmavku umiestnite na 60 minút do vodného kúpeľa (6.10).
 8.3.3.
 Odstreďte (6.2) počas 10 minút pri 2 200 g alebo prefiltrujte cez papier (6.6) a prvých 5 ml filtrátu vylejte.
 8.4.
 Chromatografické stanovenie
 8.4.1.
 Metóda HPLC s reverznou fázou vylučuje možnosť falošne pozitívnych výsledkov spôsobených prítomnosťou sušeného kyslého cmaru.
 8.4.2.
 Pred uskutočnením analýzy HPLC s reverznou fázou je potrebné optimalizovať podmienky gradientu. Optimálnym retenčným časom pre CMP A v prípade gradientových systémov s mŕtvym objemom asi 6 ml (objem od bodu, kde sa spájajú rozpúšťadlá, do objemu nástrekovej slučky vrátane) je 26 ± 2 minúty. Pri gradientových systémoch s nižším mŕtvym objemom (napr. 2 ml) sa za optimálny retenčný čas považuje 22 minút.
 Použite roztoky štandardných vzoriek (5.4) s 50 % syridlovou srvátkou a bez nej.
 Do prístroja HPLC, pracujúceho za podmienok skúšobného gradientu uvedených v tabuľke 1 injektujte 100 μl supernatantu alebo filtrátu (8.3.3).
 Tabuľka 1
 Podmienky skúšobného gradientu pre optimalizáciu chromatografie
 Čas
 (min.)
 Prietok
 (ml/min.)
 % A
 % B
 Krivka
 Počiatočný
 1,0
 90
 10
 *
 27
 1,0
 60
 40
 lineárna
 32
 1,0
 10
 90
 lineárna
 37
 1,0
 10
 90
 lineárna
 42
 1,0
 90
 10
 lineárna
 Porovnanie dvoch chromatogramov by malo odhaliť miesto píku CMPΑ.
 Pomocou nižšie uvedeného vzorca možno vypočítať počiatočné zloženie rozpúšťadla použitého pre normálny gradient (pozri 8.4.3) % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) x 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) x 1,11
 kde:
 RTcmpA
 :
 retenčný čas CMPΑ v skúšobnom gradiente
 10
 :
 počiatočné % B skúšobného gradientu
 2,5
 :
 % B v strednom bode mínus % B na začiatku normálneho gradientu
 13,5
 :
 stredný bod skúšobného gradientu
 26
 :
 požadovaný retenčný čas CMPA
 6
 :
 pomer sklonov skúšobného a normálneho gradientu
 30
 :
 % B v počiatočnom bode mínus % B po 27 minútach v skúšobnom gradiente
 27
 :
 čas skúšobného gradientu.
 8.4.3.
 Použite roztoky testovaných vzoriek.
 Do prístroja HPLC nastaveného na prietok elučného roztoku (5.2) 1,0 ml za minútu injektujte 100 μl presne odmeraného supernatantu alebo filtrátu (8.3.3).
 Zloženie eluentu na začiatku analýzy sa získava podľa bodu 8.4.2. Za normálnych okolností je to približne A:B = 76:24 (5.2). Ihneď po injektáži sa spustí lineárny gradient, ktorý spôsobí, že po 27 minútach sa B zvýši o 5 %. Následne sa spustí lineárny gradient ktorý spôsobí, že zloženie eluentu dosiahne za päť minút 90 % B. Toto zloženie sa udržiava počas piatich minút a po piatich minútach sa zloženie zmení prostredníctvom lineárneho gradientu na počiatočné zloženie. V závislosti od vnútorného objemu čerpacieho systému je možné ďalšiu injektáž uskutočniť po 15 minútach od dosiahnutia počiatočných podmienok.
 Poznámka 1. Retenčný čas CMPA je 26 ± 2 minúty. To je možné dosiahnuť zmenou počiatočných a konečných podmienok prvého gradientu. Rozdiel v % B medzi počiatočnými a konečnými podmienkami však zostáva 5 % B.
 Poznámka 2. Eluenty by mali byť dostatočne odplynené a v takom stave by mali aj zostať. To je dôležité pre riadne fungovanie gradientového čerpacieho systému. Štandardná odchýlka retenčného času píku CMPA by mala byť menšia ako 0,1 minúty (n = 10).
 Poznámka 3. Po každých piatich vzorkách by sa mala injektovať referenčná vzorka [5], ktorá sa používa na výpočet nového responzného faktora R (9.1.1).
 8.4.4.
 Výsledky chromatografickej analýzy testovanej vzorky (E) sa získavajú vo forme chromatogramu, v ktorom je pík CMPA identifikovaný svojim retenčným časom približne 26 minút.
 Výšku H píku CMPA automaticky vypočítava integrátor (6.11.6). V každom chromatograme je potrebné skontrolovať umiestnenie základnej čiary. Ak je základná čiara umiestnená nesprávne, analýzu alebo integráciu je potrebné opakovať.
 Poznámka: Ak je pík CMPA dostatočne oddelený od ostatných píkov, malo by sa použiť umiestnenie základnej čiary „valley-to-valley“. V opačnom prípade použite zvislé kolmice na obvyklú základnú čiaru, ktorých počiatočný bod by mal byť v blízkosti píku CMPA (teda nie v čase t = 0 min.!). V prípade štandardnej vzorky aj vzoriek použite rovnaký druh integrácie a v prípade obvyklej základnej čiary skontrolujte jej zhodnosť pre vzorky a štandardnú vzorku.
 Pred kvantitatívnou interpretáciou je dôležité preskúmať vzhľad každého chromatogramu s cieľom zistiť akékoľvek abnormality zapríčinené buď poruchou prístroja alebo kolóny, alebo pôvodom a povahou analyzovanej vzorky. V prípade pochybností analýzu zopakujte.
 8.5.
 Kalibrácia
 8.5.1.
 Pri štandardných vzorkách (5.4.1 až 5.4.2) použite presne postup opísaný v bodoch 8.2 až 8.4.4. Použite čerstvo pripravené roztoky, pretože CMP v prostredí 8 % kyseliny trichlóroctovej pri izbovej teplote degraduje. Pri 4 °C je roztok stabilný počas 24 hodín. V prípade dlhých sérií analýz je v automatickom injektore vhodné použiť chladený zásobník na vzorky.
 Poznámka: Krok 8.4.2. je možné vynechať ak je % B v počiatočných podmienkach známe z predchádzajúcich analýz.
 Chromatogram referenčnej vzorky [5] by mal byť analogický s obrázkom. 1. Na tomto obrázku predchádzajú píku CMPA dve malé píky. Je nevyhnutné dosiahnuť podobnú separáciu.
 8.5.2.
 Pred chromatografickou analýzou vzoriek injektujte 100 μl štandardnej vzorky bez syridlovej srvátky [0] (5.4.1).
 Na chromatograme by nemal byť pík v retenčnom čase CMPA.
 8.5.3.
 Responzné faktory R stanovte injektovaním rovnakého objemu filtrátu (8.5.1), aký sa použil pri vzorkách.
 9.VYJADRENIE VÝSLEDKOV
 9.1.
 Metóda výpočtu a vzorce
 9.1.1.
 Výpočet responzného faktora R:
 pík CMPA: R = W/H
 kde:
 R
 =
 reakčný faktor píku CMPA
 H
 =
 výška píku CMPA
 W
 =
 množstvo srvátky v štandardnej vzorke [5]
 9.2.
 Výpočet percentuálneho podielu sušenej syridlovej srvátky vo vzorke
 W(E) = R × H(E)
 kde:
 W(E)
 =
 hmotnostné percento syridlovej srvátky vo vzorke (E)
 R
 =
 responzný faktor píku CMPA (9.1.1)
 H(E)
 =
 výška píku CMPA vzorky (E)
 Sušina syridlovej srvátky je prítomná, ak W(E) je väčšie ako 1 % a rozdiel medzi retenčným časom a retenčným časom štandardnej vzorky [5] je menší ako 0,2 minúty.
 9.3.
 Presnosť postupu
 9.3.1.
 Opakovateľnosť
 Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených naraz alebo rýchlo po sebe rovnakým analytikom s použitím rovnakých prístrojov na identickom testovanom materiáli nesmie presiahnuť 0,2 % m/m.
 9.3.2.
 Reprodukovateľnosť
 Nestanovená.
 9.3.3.
 Linearita
 Pre hodnoty od 0 do 16 % syridlovej srvátky by sa mala dosiahnuť lineárna závislosť s koeficientom korelácie > 0,99.
 9.4.
 Interpretácia
 Limit 1 % zahŕňa neistotu s ohľadom na reprodukovateľnosť.
 Obrázok 1
 Ni –4,6 štandard
 “
 3. Dopĺňajú sa tieto prílohy:
 „PRÍLOHA VI
 Metódy analýzy masla v súkromnom skladovaní
 Parameter
 Metóda
 Tuk
 7
 ISO 17189 alebo ISO 3727 časť 3
 Voda
 ISO 3727 časť 1
 Beztuková sušina (okrem soli)
 ISO 3727 časť 2
 Soľ
 ISO 15648
 PRÍLOHA VII
 Metóda analýzy sušeného odstredeného mlieka v súkromnom skladovaní
 Parameter
 Metóda
 Tuk
 ISO 1736
 Bielkoviny
 ISO 8968 časť 1
 Voda
 ISO 5537
 PRÍLOHA VIII
 Metódy analýzy syrov v súkromnom skladovaní
 1. Na overenie toho, že syr, ktorý sa vyrába výlučne z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesi ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka, neobsahuje kazeín z kravského mlieka, sa používa analytická metóda uvedená v dodatku.
 Prítomnosť kazeínu z kravského mlieka sa považuje za preukázanú, ak je obsah kazeínu z kravského mlieka v analyzovanej vzorke rovnaký alebo vyšší ako obsah v referenčnej vzorke obsahujúcej 1 % kravského mlieka, ako sa uvádza v dodatku.
 2. Metódy na zisťovanie prítomnosti kazeínu z kravského mlieka v syroch uvedených odseku 1 je možné použiť, ak:
 a) detekčný limit je maximálne 0,5 % a
 b) neexistujú žiadne falošne pozitívne výsledky a
 c) kazeín z kravského mlieka je zistiteľný s požadovanou citlivosťou aj po dlhom čase zrenia, k čomu môže dôjsť v bežných obchodných podmienkach.
 Ak nie je splnená niektorá z uvedených požiadaviek, použijú sa referenčné metódy uvedené v dodatku.
 Dodatok
 METÓDA ZISŤOVANIA PRÍTOMNOSTI KRAVSKÉHO MLIEKA A KAZEINÁTU V SYROCH VYROBENÝCH Z OVČIEHO MLIEKA, KOZIEHO MLIEKA ALEBO BYVOLIEHO MLIEKA, ALEBO ZO ZMESÍ KOZIEHO, OVČIEHO A BYVOLIEHO MLIEKA
 1.ROZSAH
 Zisťovanie prítomnosti kravského mlieka a kazeinátu v syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka izoelektrickou fokusáciou γ-kazeínov po plazminolýze.
 2.OBLASŤ POUŽITIA
 Metóda je vhodná na citlivé a špecifické zisťovanie prírodného a tepelne upraveného mlieka a kazeinátu v čerstvých a zrejúcich syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka. Nie je vhodná na zisťovanie falšovania mlieka a syra tepelne upravenými bielkovinovými koncentrátmi z kravskej srvátky.
 3.PRINCÍP METÓDY
 3.1.
 Izolácia kazeínov zo syra a referenčných štandardov
 3.2.
 Rozpustenie izolovaných kazeínov a prevedenie plazmínového (EC.3.4.21.7) štiepenia
 3.3.
 Izoelektrická fokusácia plazmínovaných kazeínov za prítomnosti močoviny a farbenie bielkovín
 3.4.
 Hodnotenie zafarbených γ3 a γ2-kazeínových záznamov (dôkaz prítomnosti kravského mlieka) porovnaním záznamu získaného zo vzorky so záznamami získanými z rovnakého gélu z referenčných štandardných roztokov obsahujúcich 0 % a 1 % kravského mlieka.
 4.REAGENTY
 Ak nie je uvedené inak, použijú sa chemikálie analytickej kvality. Použije sa dvojnásobne destilovaná voda alebo voda ekvivalentnej čistoty.
 Poznámka: Nasledujúci podrobný popis použite na laboratórne pripravené polyakrylamidové gély obsahujúce močovinu s rozmermi 265 × 125 × 0,25 mm. Ak sa použije iná veľkosť a typ gélu, môže byť potrebná úprava podmienok separácie.
 Izoelektrická fokusácia
 4.1.
 Reagenty pre výrobu polyakrylamidových gélov obsahujúcich močovinu
 4.1.1.
 Zásobný gélový roztok
 Vo vode rozpusťte:
 4,85 g akrylamidu
 0,15 g N, N'-metyléndiakrylamidu (BIS)
 48,05 g močoviny
 15,00 g glycerolu (87 % hm.)
 doplňte vodou do 100 ml a uskladnite vo fľaši z hnedého skla v chladničke.
 Poznámka: Namiesto uvedených pevne stanovených hmotností neurotoxických akrylamidov možno použiť komerčne dostupný namiešaný roztok akrylamidu a BIS. Ak takýto roztok obsahuje 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, namiesto uvedených presne stanovených hmotností sa na zmiešanie roztoku použije objem 16,2 ml komerčného roztoku. Trvanlivosť zásobného roztoku je maximálne 10 dní; ak je jeho vodivosť väčšia ako 5 μS, deionizujte ho miešaním s 2 g amberlitu MB-3 počas 30 minút a potom ho prefiltrujte cez membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm.
 4.1.2.
 Gélový roztok
 Gélový roztok pripravte zmiešaním aditív a amfolytov
 8
 so zásobným gélovým roztokom (pozri 4.1.1).
 9,0 ml zásobného roztoku
 24 mg β-alanínu
 500 μl amfolytu pH 3,5 – 9,5
 250 μl amfolytu pH 5 – 7
 250 μl amfolytu pH 6 – 8
 Gélový roztok zmiešajte a odplyňte počas dvoch až troch minút v ultrazvukovom kúpeli alebo vo vákuu.
 Poznámka: Gélový roztok pripravte tesne pred jeho použitím (pozri 6.2).
 4.1.3.
 Katalytické roztoky
 4.1.3.1.
 N, N, N', N'-tetrametyletyléndiamín (Temed)
 4.1.3.2.
 40 % hm./obj. peroxodisíran diamónny (PER):
 Rozpusťte 800 mg PER vo vode a doplňte vodu do 2 ml.
 Poznámka: Vždy používajte čerstvo pripravený roztok PER.
 4.2.
 Kontaktná kvapalina
 Kerozín alebo kvapalný parafín
 4.3.
 Anódový roztok
 Vo vode rozpusťte 5,77 g kyseliny fosforečnej (85 % hm.) a doplňte na 100 ml.
 4.4.
 Katódový roztok
 Vo vode rozpusťte 2 g hydroxidu sodného a doplňte vodou na 100 ml.
 Príprava vzorky
 4.5.
 Reagenty na izoláciu bielkovín
 4.5.1.
 Zrieďte kyselinu octovú (25 ml ľadovej kyseliny octovej doplňte vodou do 100 ml.)
 4.5.2.
 Dichlórmetán
 4.5.3.
 Acetón
 4.6.
 Tlmivý roztok rozpúšťajúci bielkoviny
 Vo vode rozpusťte
 5,75 g glycerolu (87 % hm.)
 24,03 g močoviny
 250 mg (+-)-(R*,R*)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu (dithiothreitolu)
 doplňte vodou do 50 ml.
 Poznámka: Skladujte v chladničke; maximálna trvanlivosť je jeden týždeň.
 4.7.
 Reagenty pre plazmínové štiepenie kazeínov
 4.7.1.
 Tlmivý roztok uhličitanu amónneho
 Titrujte roztok 0,2 mol/l hydrogénuhličitanu amónneho (1,58 g/100 ml vody) obsahujúci 0,05 mol/l kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA, 1,46 g/100 ml) s 0,2 mol/l roztokom uhličitanu amónneho (1,92 g/100 ml vody) obsahujúcim 0,05 mol/l EDTA na pH 8.
 4.7.2.
 Plazmín z kravského mlieka (EC. 3.4.21.7), s aktivitou najmenej 5 U/ml
 4.7.3.
 Roztok kyseliny ε-aminohexánovej na inhibíciu enzýmov
 Rozpusťte 2,624 g kyseliny ε-aminohexánovej (kyselina 6-amino-n-hexánová) v 100 ml 40 % (obj.) etanolu.
 4.8.
 Referenčné štandardy
 4.8.1.
 Certifikované referenčné štandardy zmesi odstredeného ovčieho a kozieho mlieka upraveného syridlom s obsahom 0 % a 1 % kravského mlieka sú dostupné v Inštitúte Komisie pre referenčné materiály a merania (Commission's Institute for Reference Materials and Measurements), B-2440 Geel, Belgicko.
 4.8.2.
 Príprava dočasných laboratórnych štandardných roztokov pre byvolie mlieko upravené syridlom s obsahom 0 % a 1 % kravského mlieka.
 Odstredené mlieko sa pripraví odstredením buď byvolieho, alebo kravského surového mlieka pri podmienkach 37 °C, 2 500 g, 20 minút. Po rýchlom ochladení skúmavky a jej obsahu na 6 až 8 °C sa úplne odstráni horná vrstva tuku. Na prípravu 1 % štandardu pridajte do 495 ml byvolieho odstredeného mlieka 5 ml kravského odstredeného mlieka v kadičke s objemom 1 liter a pridaním zriedenej kyseliny mliečnej (10 % hm./obj.) upravte pH na 6,4. Teplotu nastavte na 35 °C a pridajte 100 μl teľacieho syridla (aktivita syridla 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), miešajte 1 minútu a potom kadičku prikryte hliníkovou fóliou a nechajte jednu hodinu odstáť pri teplote 35 °C, aby sa vytvoril tvaroh. Po vytvorení tvarohu celé mlieko upravené syridlom vysušte mrazom bez predošlej homogenizácie alebo zliatia srvátky. Po vysušení mrazom je roztok vhodný na vytvorenie homogénneho prášku. Na prípravu 0 % štandardného roztoku uskutočnite rovnaký postup s použitím pravého byvolieho odstredeného mlieka. Štandardy sa musia skladovať pri teplote –20 °C.
 Poznámka: Pred prípravou štandardného roztoku sa odporúča skontrolovať čistotu byvolieho mlieka izoelektrickou fokusáciou plazmínovaných kazeínov.
 Reagenty na farbenie bielkovín
 4.9.
 Ustaľovač
 Vo vode rozpusťte 150 g kyseliny trichlóroctovej a doplňte na 1 000 ml.
 4.10.
 Roztok na odfarbovanie
 Rozrieďte 500 ml metanolu a 200 ml ľadovej kyseliny octovej s destilovanou vodou na 2 000 ml.
 Poznámka: Roztok na odfarbovanie pripravte každý deň čerstvý; môže sa pripraviť zmiešaním rovnakých objemov zásobných roztokov 50 % (obj.) metanolu a 20 % (obj.) ľadovej kyseliny octovej.
 4.11.
 Roztoky na farbenie
 4.11.1.
 Roztok na farbenie (zásobný roztok 1)
 Rozpusťte 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1 000 ml 90 % (obj.) metanolu magnetickým miešadlom (miešajte asi 45 minút), prefiltrujte cez dva stredne rýchle skladané filtre.
 4.11.2.
 Roztok na farbenie (zásobný roztok 2)
 V 1 000 ml 20 % (obj.) kyseliny octovej rozpusťte 5,0 g pentahydrátu síranu meďnatého.
 4.11.3.
 Roztok na farbenie (pracovný roztok)
 Bezprostredne pred farbením zmiešajte 125 ml oboch zásobných roztokov (4.11.1, 4.11.2).
 Poznámka: Roztok na farbenie by sa mal pripraviť v deň použitia.
 5.VYBAVENIE
 5.1.
 Sklenené platničky (265 x 125 x 4 mm); gumený valček (šírka 15 cm); vyrovnávacia tabuľka.
 5.2.
 Fólia na gél (265 × 125 mm)
 5.3.
 Krycia fólia (280 × 125 mm). Na oba dlhé konce upevnite pás lepiacej pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (pozri obrázok 1).
 5.4.
 Elektrofokusačná komora s chladiacou doskou (napr. 265 × 125 mm) a vhodným zdrojom energie (≥ 2,5 kV) alebo automatické elektroforézne zariadenie
 5.5.
 Cirkulačný kryostat s termostatickou kontrolou na 12 ± 0,5 °C
 5.6.
 Odstredivka nastaviteľná na 3 000 g
 5.7.
 Elektródy (≥ 265 mm dlhé)
 5.8.
 Plastové fľaše s kvapkadlom na anódový a katódový roztok
 5.9.
 Aplikátory vzoriek (10 × 5 mm, viskózový papier alebo papier s nízkou absorpciou bielkovín)
 5.10.
 Nerezové alebo sklené misky na farbenie a odfarbovanie (napr. podnosy na nástroje s rozmermi 280 × 150 mm)
 5.12.
 Nastaviteľný tyčový homogenizátor (priemer hriadeľa 10 mm), 8 000 až 20 000 ot/min
 5.13.
 Magnetické miešadlo
 5,14.
 Ultrazvukový kúpeľ
 5.15.
 Zváračka fólií
 5.16.
 Mikropipety na 25 μl
 5.17.
 Vákuový koncentrátor alebo lyofilizátor
 5.18.
 Termostaticky kontrolovaný vodný kúpeľ nastaviteľný na 35 a 40 ± 1 °C, s možnosťou pretrepania
 5.19.
 Denzitometer umožňujúci meranie pri vlnovej dĺžke λ = 634 nm
 6.POSTUP
 6.1.
 Príprava vzorky
 6.1.1.
 Izolácia kazeínov
 Do odstreďovacej skúmavky s objemom 100 ml odvážte množstvo syra alebo referenčných štandardov zodpovedajúce 5 g sušiny, pridajte 60 ml destilovanej vody a homogenizujte tyčovým homogenizátorom (8 000 až 10 000 ot/min). Hodnotu pH upravte na 4,6 zriedenou kyselinou octovou (4.5.1) a odstreďte (5 minút, 3 000 g). Zlejte tuk a srvátku, rezíduum homogenizujte pri 20 000 ot/min v 40 ml destilovanej vody s pH upraveným na 4,5 zriedenou kyselinou octovou (4.5.1), pridajte 20 ml dichlórmetánu (4.5.2), opäť homogenizujte a odstreďte (5 minút, 3 000 g). Špachtličkou odstráňte vrstvu kazeínu, ktorá sa nachádza medzi vodnou a organickou vrstvou (pozri obrázok 2) a zlejte obe vrstvy. Kazeín znova homogenizujte v 40 ml destilovanej vody (pozri vyššie) a 20 ml dichlórometánu (4.5.2.) a odstreďte. Tento postup opakujte, pokým nebudú obe extrakčné vrstvy bezfarebné (dva až trikrát). Bielkovinové rezíduum homogenizujte s 50 ml acetónu (4.5.3) a prefiltrujte cez stredne rýchly skladaný filtračný papier. Rezíduum z filtra zakaždým zmyte dvoma osobitnými 25 ml dávkami acetónu a nechajte vyschnúť na vzduchu alebo pod prúdom dusíka a potom ho rozdrvte na jemný prášok v mažiari.
 Poznámka: Suché izoláty kazeínu by sa mali skladovať pri –20 °C.
 6.1.2.
 Plazmínové štiepenie β-kazeínov na intenzifikáciu γ-kazeínov
 V 0,5 ml tlmivého roztoku uhličitanu amónneho (4.7.1.) rozpusťte 25 mg izolovaných kazeínov (6.1.1.) a 20 minút ich homogenizujte napr. použitím ultrazvuku. Zohrejte ich na 40 °C a pridajte 10 μl plazmínu (4.7.2), premiešajte a inkubujte 1 hodinu pri teplote 40 °C za stáleho pretrepávania. Na inhibovanie enzýmu pridajte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminohexánovej (4.7.3) a následne pridajte 200 mg pevnej močoviny a 2 mg (2R,3S)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu (dithiothreitolu).
 Poznámka: Na dosiahnutie väčšej symetrie vo fokusovaných kazeínových pásoch je vhodné roztok po pridaní kyseliny ε-aminohexánovej mrazom vysušiť a rezíduá potom rozpustiť v 0,5 ml tlmivého roztoku rozpúšťajúceho bielkoviny (4.6.)
 6.2.
 Príprava polyakrylamidových gélov s obsahom močoviny
 Pomocou niekoľkých kvapiek vody rozbaľte fóliu na gél (5.2) na sklenenú platničku (5.1) a prebytočnú vodu odstráňte papierovým obrúskom. Na ďalšiu platničku rozložte rovnakým spôsobom kryciu fóliu (5.3) s rozpernými vložkami (0,25 mm). Platničku horizontálne položte na vyrovnávaciu tabuľku.
 Do pripraveného a odvzdušneného gélového roztoku (4.1.2) pridajte 10 μl Temedu (4.1.3.1), premiešajte a pridajte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2), dôkladne premiešajte a ihneď rovnomerne nalejte na stred krycej fólie. Jeden okraj platničky s gélom (s fóliou otočenou smerom dole) položte na platničku s krycou fóliou a pomaly ju pritlačte tak, aby sa medzi platničkami vytvorila rovnomerne rozotretá gélová vrstva bez bubliniek (obrázok 3). Pomocou tenkej špachtle opatrne pritlačte doštičku s gélom po celom povrchu a na vrch umiestnite ďalšie tri sklenené doštičky ako závažie. Po ukončení polymerizácie (približne 60 minút) odstráňte gél polymerizovaný na fólii na gél spolu s krycou fóliou tak, že sklenené doštičky nakloníte. Opačnú stranu fólie na gél pozorne očistite, aby ste odstránili zvyšky gélu a močovinu. Gélový „sendvič“ zvarte do fólie a uskladnite stočený do rúrky v chladničke (maximálne šesť týždňov).
 Poznámka: Kryciu fóliu s rozpernými vložkami možno znovu použiť. Polyakrylamidový gél možno rozrezať na menšie kúsky, čo sa odporúča vtedy, ak je málo vzoriek, alebo ak sa používa automatické elektroforézne zariadenie (dva gély s rozmermi 4,5 × 5 cm).
 6.3.
 Izoelektrická fokusácia
 Chladiaci termostat nastavte na 12 °C. Opačnú stranu fólie na gél očistite kerozínom, potom kvapnite niekoľko kvapiek kerozínu (4.2) do stredu chladiaceho bloku. Potom naň položte gélový sendvič, s fóliou otočenou smerom nadol, a vyhnite sa pritom vzniku bubliniek. Prebytočný kerozín zotrite a odstráňte kryciu fóliu. Elektródové pásy ponorte do elektródových roztokov (4.3, 4.4), odrežte na dĺžku gélu a umiestnite na dané miesta (vzdialenosť elektród 9,5 cm).
 Podmienky izoelektrickej fokusácie:
 6.3.1.
 Rozmer gélu 265 × 125 × 0,25 mm
 Krok
 Čas
 (min.)
 Napätie
 (V)
 Prúd
 (mA)
 Výkon
 (W)
 Volthodiny
 (Vh)
 1. Predbežná fokusácia
 30
 maximálne
 2 500
 maximálne
 15
 konštantný 4
 c. 300
 2. Fokusácia vzorky
 9
 60
 maximálne
 2 500
 maximálne
 15
 konštantný 4
 c. 1 000
 3. Záverečná fokusácia
 60
 maximálne
 2 500
 maximálne
 5
 maximálne
 20
 c. 3 000
 40
 maximálne
 2 500
 maximálne
 6
 maximálne
 20
 c. 3 000
 30
 maximálne
 2 500
 maximálne
 7
 maximálne
 25
 c. 3 000
 Poznámka:
 Ak sa zmení hrúbka alebo šírka gélov, hodnoty prúdu a výkonu sa musia vhodne upraviť (napr. dvojnásobok hodnoty pre elektrický prúd a výkon, ak sa používa gél s rozmermi 265 × 125 × 0,5 mm).
 6.3.2.
 Príklad programu napätia pre automatické elektroforézne zariadenie (2 gély s rozmermi 5 × 4,5 cm), elektródy bez pásov sa prikladajú priamo na gél.
 Krok
 Napätie
 Prúd
 Výkon
 Teplota
 Volthodiny
 1. Predbežná fokusácia
 1 000 V
 10,0 mA
 3,5 W
 8 °C
 85 Vh
 2. Fokusácia vzorky
 250 V
 5,0 mA
 2,5 W
 8 °C
 30 Vh
 3. Fokusácia
 1 200 V
 10,0 mA
 3,5 W
 8 °C
 80 Vh
 4. Fokusácia
 1 500 V
 5,0 mA
 7,0 W
 8 °C
 570 Vh
 Aplikátor vzorky vložte v kroku 2 pri 0 Vh.
 Aplikátor vzorky odstráňte v kroku 2 pri 30 Vh.
 6.4.
 Farbenie bielkovín
 6.4.1.
 Ustálenie bielkovín
 Ihneď po vypnutí zariadenia odstráňte elektródové pásy a gél ihneď vložte do misky na farbenie/odfarbovanie naplnenej ustaľovačom (4.9.) v objeme 200 ml; za stáleho pretrepávania nechajte pôsobiť 15 min.
 6.4.2.
 Umývanie a farbenie gélovej platničky
 Dôkladne odstráňte ustaľovač a gélovú platničku premyte dvakrát počas 30 sekúnd 100 ml roztokom na odfarbovanie (4.10). roztok na odfarbovanie vylejte a misku naplňte 250 ml roztokom na farbenie (4.11.3.); nechajte ho pôsobiť za jemného pretrepávania počas 45 minút.
 6.4.3.
 Odfarbenie gélovej platničky
 Roztok na farbenie vylejte, gélovú platničku zakaždým dvakrát premyte pomocou 100 ml roztoku na odfarbovanie (4.10.), následne pretrepte s 200 ml roztoku na odfarbovanie počas 15 minút a postup odfarbenia opakujte najmenej dva alebo trikrát, pokým nie je pozadie čisté a bezfarebné. Potom gélovú platničku opláchnite destilovanou vodou (2 × 2 minúty) a nechajte vysušiť na vzduchu (2 až 3 hodiny) alebo sušičom na vlasy (10 až 15 minút).
 Poznámka 1:
 Ustálenie, umývanie, farbenie a odfarbovanie vykonávajte pri teplote 20 °C. Nepoužívajte vyššie teploty.
 Poznámka 2:
 Ak sa uprednostní citlivejšie strieborné farbivo (napr. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No. 17-1150-01), musia byť kazeínové vzorky ošetrené plazmínom zriedené na 5 mg/ml.
 7.HODNOTENIE
 Hodnotenie sa vykonáva porovnaním záznamov bielkovín neznámej vzorky s referenčnými štandardmi na tom istom géle. Obsah kravského mlieka v syroch z ovčieho mlieka, kozieho mlieka a byvolieho mlieka a zo zmesí ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka sa detekuje prostredníctvom γ3- a γ2-kazeínov, ktorých izoelektrické body sú v rozmedzí pH 6,5 a pH 7,5 (obrázky 4a, 4b a 5). Detekčný limit je nižší ako 0,5 %.
 7.1.
 Vizuálny odhad
 Pri vizuálnom hodnotení množstva kravského mlieka sa odporúča upraviť koncentrácie vzoriek a štandardných roztokov s cieľom dosiahnuť rovnakú úroveň intenzity v prípade ovčích, kozích a/alebo byvolích γ2- a γ3-kazeínov (pozri hodnoty ‚„γ2 E,G,B“ a „γ3 E,G,B“ v obrázkoch 4a, 4b a 5) Následne možno posúdiť množstvo kravského mlieka (menej ako 1 %, 1 % alebo viac ako 1 %) v neznámej vzorke, a to priamo porovnaním intenzity hovädzích γ3- a γ2-kazeínov (pozri „γ3 C“ a „'γ2 C“ na obrázkoch 4a, b a na obrázku 5) s intenzitou kazeínov v 0 % a 1 % referenčných štandardoch (ovčie, kozie) alebo v dočasných laboratórnych štandardoch (byvolie).
 7.2.
 Denzitometrický odhad
 Ak je to možné, na stanovenie pomeru plochy píku kravských k ovčím, kozím a/alebo byvolím γ2- a γ3-kazeínom použite denzitometriu (5.19.) (pozri obrázok 5). Túto hodnotu porovnajte s pomerom plochy píku γ2- a γ3-kazeínov 1 % referenčného štandardného roztoku (ovčie, kozie) alebo dočasného laboratórneho štandardu (byvolie) analyzovanými na tom istom géle.
 Poznámka:
 Metóda funguje uspokojivo, ak je jasný pozitívny signál v prípade oboch hovädzích γ2- a γ3-kazeínov v 1 % referenčnom štandarde , ale nie v 0 % referenčnom štandarde. V opačnom prípade postup optimalizujte presným dodržaním pokynov stanovených v danej metóde.
 Vzorka sa hodnotí ako pozitívna, ak sa oba kravské γ2- a γ3-kazeíny alebo zodpovedajúce pomery plochy píku rovnajú alebo sú väčšie ako úroveň 1 % referenčného štandardu.
 8.ODKAZY
 Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).
 Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).
 Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).
 Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).
 Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).
 Obrázok 1
 Schematický nákres krycej fólie
 Obrázok 2
 Kazeínová vrstva plávajúca medzi vodnou a organickou fázou po odstredení
 Obrázok 3
 Klapková technika liatia ultratenkých polyakrylamidových gélov
 a = oddeľovacia páska (0,25 mm); b = krycia fólia (5.3.); c, e = sklenené platničky (5.1.); d = gélový roztok (4.1.2.); f = fólia na gél (5.2.)
 Obrázok 4a
 Izoelektrická fokusácia kazeínov ošetrených plazmínom z ovčieho a kozieho syra s obsahom rôznych množstiev kravského mlieka
 % CM = percentuálny podiel kravského mlieka, C = krava, E = ovca, G = koza
 Znázornená je horná polovica izoelektricky fokusovaného gélu.
 Obrázok 4b
 Izoelektrická fokusácia kazeínov ošetrených plazmínom zo syra vyrobeného zo zmesí ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka s obsahom rôznych množstiev kravského mlieka.
 % CM = percentuálny podiel kravského mlieka; 1+ = vzorka obsahujúca 1 % kravského mlieka s pridaním čistého kravského kazeínu v strede stopy. C = krava, E = ovca, G = koza, B = byvol.
 Znázornená je celková separačná vzdialenosť izoelektricky fokusovaného gélu.
 Obrázok 5
 Superpozícia denzitogramov štandardných roztokov (STD) a vzoriek syra vyrobeného zo zmesi ovčieho a kozieho mlieka po izoelektrickej fokusácii
 a, b = štandardné vzorky s obsahom 0 a 1 % kravského mlieka; c – g = vzorky kozích syrov s obsahom 0, 1, 2, 3 a 7 % kravského mlieka. C = krava, E = ovca, G = koza.
 Horná polovica IEF gélu bola skenovaná pri λ = 634 nm.
 PRÍLOHA IX
 Hodnotenie analýz
 1. Zabezpečenie kvality
 Analýzy sa vykonávajú v laboratóriách určených v súlade s článkom 12 nariadenia (ES) č. 882/2004
 10
 alebo vymenovaných príslušným orgánmi členského štátu.
 2. Odber vzoriek a spory týkajúce sa výsledkov analýz
 1. Vzorky sa odoberajú v súlade s príslušným nariadením vzťahujúcim sa na posudzovaný výrobok. Ak nie sú výslovne stanovené žiadne ustanovenia o odbere vzoriek, použijú sa ustanovenia normy ISO 707 – Mlieko a mliečne výrobky – návod na odber vzoriek.
 2. Laboratórne správy o výsledkoch analýz obsahujú dostatočné informácie na vyhodnotenie výsledkov, ktoré sa vykoná v súlade s dodatkom.
 3. Na analýzy požadované podľa pravidiel Únie sa odoberajú duplicitné vzorky.
 4. Ak vznikne spor v súvislosti s výsledkami, platobná agentúra nechá opätovne vykonať potrebnú analýzu dotknutého výrobku, pričom náklady znáša strana, ktorá v spore nebola úspešná.
 Uvedená analýza sa vykoná za predpokladu, že sú k dispozícii zapečatené duplicitné vzorky výrobku a že tieto boli riadne uskladnené na príslušnom orgáne. Výrobca zašle platobnej agentúre žiadosť, aby vykonala analýzu do 7 pracovných dní po oznámení výsledkov prvej analýzy. Platobná agentúra vykoná túto analýzu do 21 pracovných dní od prijatia žiadosti.
 5. Výsledok odvolacieho konania sa považuje za konečný.
 6. Ak môže hospodársky subjekt do piatich pracovných dní od odberu vzorky dokázať, že postup odberu vzorky sa neuskutočnil správne, odber vzorky sa podľa možnosti zopakuje. Ak sa odber vzorky nemôže zopakovať, zásielka sa akceptuje.
 Dodatok
 Hodnotenie súladu zásielky so zákonom stanovenými medznými hodnotami
 1. Princíp
 Ak sa v právnych predpisoch týkajúcich sa verejnej intervencie a súkromného skladovania stanovujú podrobné postupy odberu vzoriek, dodržia sa tieto postupy. Vo všetkých ostatných prípadoch sa používajú najmenej tri jednotky vzorky náhodne odobraté zo zásielky predloženej na kontrolu. Môže sa pripraviť súhrnná vzorka. Získaný výsledok sa porovnáva so zákonom stanovenými medznými hodnotami na základe výpočtu 95 % intervalu spoľahlivosti ako dvojnásobku štandardnej odchýlky, pričom príslušná štandardná odchýlka závisí od toho, 1. či je metóda validovaná prostredníctvom medzinárodnej spolupráce na základe hodnôt pre σr a σR, alebo 2. v prípade internej validácie od toho, či je vypočítaná interná reprodukovateľnosť. Tento interval spoľahlivosti sa potom rovná neistote merania výsledku.
 2. METÓDA JE VALIDOVANÁ PROSTREDNÍCTVOM MEDZINÁRODNEJ SPOLUPRÁCE
 V tomto prípade sa stanovila štandardná odchýlka opakovateľnosti σr a štandardná odchýlka reprodukovateľnosti σR a laboratórium môže preukázať zhodu s prevádzkovými charakteristikami validovanej metódy.
 Vypočítajte aritmetický priemer
 z počtu n opakovaných meraní.
 Vypočítajte rozšírenú neistotu (k = 2) z
 takto:
 Ak sa konečný výsledok x merania vypočíta podľa vzorca v tvare
 ,
 ,
 alebo
 , v takýchto prípadoch sa dodržiavajú zvyčajné postupy kombinovania štandardných odchýlok.
 Zásielka sa považuje za zásielku nespĺňajúcu hornú zákonom stanovenú medznú hodnotu UL, ak
 ;
 inak sa považuje za zásielku, ktorá je v súlade s UL.
 Zásielka sa považuje za zásielku nespĺňajúcu dolnú zákonom stanovenú medznú hodnotu LL, ak
 ;
 inak sa považuje za zásielku, ktorá je v súlade s LL.
 3. INTERNÁ VALIDÁCIA NA ZÁKLADE VÝPOČTU ŠTANDARDNEJ ODCHÝLKY INTERNEJ REPRODUKOVATEĽNOSTI
 V prípadoch, v ktorých sa používajú metódy, ktoré nie sú vymedzené v tomto nariadení, a neboli stanovené presné kritériá, vykoná sa interná validácia. Namiesto σr a σR sa vo vzorci na výpočet rozšírenej neistoty U použije štandardná odchýlka internej opakovateľnosti sir a štandardná odchýlka internej reprodukovateľnosti siR.
 Pravidlá, ktoré sa majú dodržiavať na účely overenia súladu so zákonom stanovenou medznou hodnotou, sú stanovené v bode 1. Ak sa však zásielka považuje za nespĺňajúcu zákonom stanovenú medznú hodnotu, merania sa zopakujú s použitím metódy určenej v tomto nariadení a výsledok sa vyhodnotí v súlade s bodom 1.“
 (1)
 Použitú metódu schvaľuje platobná agentúra.
 (2)
 Analýzy pripálených častíc možno vykonávať systematicky. Takéto analýzy by sa však vždy mali vykonávať v prípade, že sa nevykonávajú žiadne zmyslové kontroly.
 (3)
 Použitú metódu schvaľuje platobná agentúra.
 (4)
 Použitú metódu schvaľuje platobná agentúra.
 (5)
 Zmyslové kontroly sa vykonávajú v prípade, že sa považujú za potrebné na základe analýzy rizík schválenej platobnou agentúrou.
 (6)
 Medzinárodná norma IDF 135B/1991. Milk and milk products. Precision characteristics of analytical methods. Outline of collaborative study procedure. (Mlieko a mliečne výrobky. Presné charakteristiky analytických metód. Prehľad spoločnej štúdie).
 (7)
 Použitú metódu schvaľuje platobná agentúra.
 (8)
 Výrobky Ampholine® pH 3,5 – 9,5 (Pharmacia) a Resolyte® pH 5 – 7 a pH 6 – 8 (BDH, Merck) sa ukázali ako mimoriadne vhodné na dosiahnutie požadovanej separácie γ-kazeínov.
 (9)
 Použitie vzorky: po predbežnej fokusácii (etapa 1) napipetujte 18 μl vzorky a štandardného roztoku do aplikátorov vzorky (10 × 5 mm), uložte ich na gél vo vzdialenosti 1 mm od seba a 5 mm pozdĺž anódy a zľahka pritlačte. Vykonajte fokusáciu podľa uvedených podmienok, po 60 minútach od fokusácie vzorky tieto aplikátory opatrne vyberte.
 (10)
 Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 z 29. apríla 2004 o úradných kontrolách uskutočňovaných s cieľom zabezpečiť overenie dodržiavania potravinového a krmivového práva, a predpisov o zdraví zvierat a o starostlivosti o zvieratá, Ú. v. EÚ L 165, 30.4.2004.


type: wikipedia

text:
Нàучене е село в Югоизточна България. То се намира в община Нова Загора, област Сливен.
 Нунатак Научене на Антарктическия полуостров е наименуван на селото.
 История на името
 В миналото, селото се е намирало в местността Авланкьой (Аланкьой, Ааланкьой) на пътя Сливен - Нова Загора. Преданието разказва, че местните под ръководството на Балабанлията нападнали и ограбили турската поща с данъците на хазната. Целта била с парите да се въоръжат и да вдигнат възстание. Въстание не се вдигнало, но за отмъщение турците опожарили селото и прокудили останалите живи негови жители да го построят на ново място. След като се разчуло за изгореното село и пътниците по пътя от Пловдив към Сливен спирали да питат защо е опожарено Аланкьой, местните турци им казвали: "Гид йоренме!" (иди да научиш - от турски). Така на новото си място селото станало Юренлик, после и Юрене. Името е променено със закон, утвърдено с указ No 462 от 13.XII.1906 г. След преврата на 19 май 1934 г. с нов указ от 14 август 1934 г. селото става Научене.
 Предходни имена на селото: Юрене, Юренлий, Юрени, Юренъ, Научен.
 Външни препратки
 Села в област Сливен
 Населени места в община Нова Загора


jurisdiction: EU

text:
 23.6.2015
 SK
 Úradný vestník Európskej únie
 L 157/40
 VYKONÁVACIE NARIADENIE KOMISIE (EÚ) 2015/967
 z 22. júna 2015,
 ktorým sa určujú množstvá, ktoré sa majú pridať k množstvu stanovenému na čiastkové obdobie od 1. októbra do 31. decembra 2015 v rámci colných kvót otvorených nariadením (ES) č. 1384/2007 na hydinové mäso s pôvodom v Izraeli
 EURÓPSKA KOMISIA,
 so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,
 so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) č. 1308/2013 zo 17. decembra 2013, ktorým sa vytvára spoločná organizácia trhov s poľnohospodárskymi výrobkami a ktorým sa zrušujú nariadenia Rady (EHS) č. 922/72, (EHS) č. 234/79, (ES) č. 1037/2001 a (ES) č. 1234/2007 (1), a najmä na jeho článok 188 ods. 2 a 3,
 keďže:
 (1)
 Nariadením Komisie (ES) č. 1384/2007 (2) sa otvorili ročné colné kvóty na dovoz výrobkov z odvetvia hydinového mäsa s pôvodom v Izraeli.
 (2)
 Množstvá, na ktoré sa vzťahujú žiadosti o dovozné povolenia podané od 1. do 7. júna 2015 na čiastkové obdobie od 1. júla do 30. septembra 2015, sú nižšie ako dostupné množstvá. Mali by sa teda určiť množstvá, na ktoré neboli podané žiadosti. Tieto množstvá treba pridať k množstvu stanovenému na nasledujúce čiastkové kvótové obdobie.
 (3)
 S cieľom zaistiť účinnosť opatrenia by toto nariadenie malo nadobudnúť účinnosť dňom jeho uverejnenia v Úradnom vestníku Európskej únie,
 PRIJALA TOTO NARIADENIE:
 Článok 1
 Množstvá, na ktoré neboli podané žiadosti o dovozné povolenia podľa nariadenia (ES) č. 1384/2007 a ktoré sa majú pridať do čiastkového obdobia od 1. októbra do 31. decembra 2015, sú uvedené v prílohe k tomuto nariadeniu.
 Článok 2
 Toto nariadenie nadobúda účinnosť dňom jeho uverejnenia v Úradnom vestníku Európskej únie.
 Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.
 V Bruseli 22. júna 2015
 Za Komisiu
 v mene predsedu
 Jerzy PLEWA
 generálny riaditeľ pre poľnohospodárstvo a rozvoj vidieka
 (1) Ú. v. EÚ L 347, 20.12.2013, s. 671.
 (2) Nariadenie Komisie (ES) č. 1384/2007 z 26. novembra 2007, ktorým sa ustanovujú podrobné pravidlá uplatňovania nariadenia Rady (ES) č. 2398/96, pokiaľ ide o otvorenie a stanovenie správy určitých colných kvót na dovoz výrobkov z hydinového mäsa z Izraela do Spoločenstva (Ú. v. EÚ L 309, 27.11.2007, s. 40).
 PRÍLOHA
 Poradové číslo
 Množstvá, na ktoré neboli podané žiadosti a ktoré sa majú pridať k množstvám, ktoré sú dostupné na čiastkové obdobie od 1. októbra do 30. decembra 2015
 (v kg)
 09.4091
 420 000
 09.4092
 2 830 000


text:
 25.1.2013
 PL
 Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej
 L 22/7
 ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) NR 66/2013
 z dnia 24 stycznia 2013 r.
 ustanawiające standardowe wartości w przywozie dla ustalania ceny wejścia niektórych owoców i warzyw
 KOMISJA EUROPEJSKA,
 uwzględniając Traktat o funkcjonowaniu Unii Europejskiej,
 uwzględniając rozporządzenie Rady (WE) nr 1234/2007 z dnia 22 października 2007 r. ustanawiające wspólną organizację rynków rolnych oraz przepisy szczegółowe dotyczące niektórych produktów rolnych („rozporządzenie o jednolitej wspólnej organizacji rynku”) (1),
 uwzględniając rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) nr 543/2011 z dnia 7 czerwca 2011 r. ustanawiające szczegółowe zasady stosowania rozporządzenia Rady (WE) nr 1234/2007 w odniesieniu do sektorów owoców i warzyw oraz przetworzonych owoców i warzyw (2), w szczególności jego art. 136 ust. 1,
 a także mając na uwadze, co następuje:
 (1)
 Rozporządzenie wykonawcze (UE) nr 543/2011 przewiduje – zgodnie z wynikami wielostronnych negocjacji handlowych Rundy Urugwajskiej – kryteria, na których podstawie ustalania Komisja ustala standardowe wartości dla przywozu z państw trzecich, w odniesieniu do produktów i okresów określonych w części A załącznika XVI do wspomnianego rozporządzenia.
 (2)
 Standardowa wartość w przywozie jest obliczana każdego dnia roboczego, zgodne z art. 136 ust. 1 rozporządzenia wykonawczego (UE) nr 543/2011, przy uwzględnieniu podlegających zmianom danych dziennych. Niniejsze rozporządzenie powinno zatem wejść w życie z dniem jego opublikowania w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej,
 PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:
 Artykuł 1
 Standardowe wartości celne w przywozie, o których mowa w art. 136 rozporządzenia wykonawczego (UE) nr 543/2011, są ustalone w załączniku do niniejszego rozporządzenia.
 Artykuł 2
 Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie z dniem jego opublikowania w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.
 Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.
 Sporządzono w Brukseli dnia 24 stycznia 2013 r.
 W imieniu Komisji, za Przewodniczącego,
 José Manuel SILVA RODRÍGUEZ
 Dyrektor Generalny ds. Rolnictwa i Rozwoju Obszarów Wiejskich
 (1) Dz.U. L 299 z 16.11.2007, s. 1.
 (2) Dz.U. L 157 z 15.6.2011, s. 1.
 ZAŁĄCZNIK
 Standardowe wartości w przywozie dla ustalania ceny wejścia niektórych owoców i warzyw
 (EUR/100 kg)
 Kod CN
 Kod państw trzecich (1)
 Standardowa wartość w przywozie
 0702 00 00
 MA
 64,4
 TN
 68,9
 TR
 120,3
 ZZ
 84,5
 0707 00 05
 EG
 200,0
 JO
 182,1
 MA
 158,2
 TR
 165,1
 ZZ
 176,4
 0709 91 00
 EG
 119,3
 ZZ
 119,3
 0709 93 10
 EG
 105,4
 MA
 89,8
 TR
 144,3
 ZZ
 113,2
 0805 10 20
 EG
 58,0
 MA
 60,3
 TN
 53,4
 TR
 63,9
 ZA
 46,1
 ZZ
 56,3
 0805 20 10
 MA
 92,5
 ZZ
 92,5
 0805 20 30, 0805 20 50, 0805 20 70, 0805 20 90
 IL
 95,5
 KR
 138,1
 MA
 158,2
 TR
 81,9
 ZZ
 118,4
 0805 50 10
 EG
 87,0
 TR
 72,4
 ZZ
 79,7
 0808 10 80
 CN
 102,2
 MK
 38,5
 US
 145,5
 ZZ
 95,4
 0808 30 90
 CN
 51,8
 US
 132,9
 ZZ
 92,4
 (1) Nomenklatura krajów ustalona w rozporządzeniu Komisji (WE) nr 1833/2006 (Dz.U. L 354 z 14.12.2006, s. 19). Kod „ZZ” odpowiada „innym pochodzeniom”.


type: other

text:
Bußgeldstelle Schleswig-Holstein Archive - blitzerkanzlei.de
 Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Wegen Überschreitung der zulässigen Höchstgeschwindigkeit in Kappeln, Kappelholz, auf der B 201, in Höhe Kreuzung Hüholz-Schoolstieg um 31 km/h, bei zulässigen 50 km/h wurde Bußgeldverfahren eröffnet. Festgestellt wurden 81 km/h. Beweismittel: Lichtschrankenmessung mit Foto Verstoß gegen: § 3 Abs. 3 , § 49 StVO, § 24 StVG, 11.3. 6 BKat, § 4 Abs. 1 BKatV ...Mehr
 Gem. Rade, Rader Hochbrücke, A7, km 61.018, in Rtg. Süden
 Gem. Rade, Rader Hochbrücke, A7, km 61.018, in Rtg. Süden “Die Fachanwälte für Verkehrsrecht bei der Blitzerkanzlei.de haben diese Messstelle bereits überprüft. Gerne beraten wir Sie umfassend und kostenlos bei Fällen zu dieser Messstelle. Sie wurden hier geblitzt oder gelasert? Dann in nur 2 Minuten kostenlose Beurteilung erhalten.” ...Mehr
 Außerorts Überschreitung der zulässigen Höchstgeschwindigkeit in Wasbeck, A 7, Km 96,950, in Richtung Hamburg wurde mit Bußgeldverfahren verfolgt, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Verstoß gegen zulässige Höchstgeschwindigkeit außerhalb geschlossener Ortschaften festgestellt. Es wurde die erlaubte Geschwindigkeit in Wasbeck, A 7, Km 96,950, in Richtung Hamburg um 70 km/h bei zulässigen 80 km/h überschritten. Festgestellt wurden 150 km/h, Beweismittel: Messung mit Lasergerät, Foto Verletzte Vorschriften: § 41 Abs. 1 iVm Anlage 2, § 49 StVO, § 24, § 25 ...Mehr
 Überschreitung der zulässigen Höchstgeschwindigkeit in Fleckeby, Am Holm, B 76 festgestellt, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Mit 24 km/h über der zulässigen Höchstgeschwindigkeit von 30 km/h in Fleckeby, Am Holm, B 76 innerhalb geschlossener Ortschaften gemessen worden. Beweismittel: Lichtschrankenmessung mit Foto Verletzte Vorschriften: § 41 Abs. 1 iVm Anlage 2, § 49 StVO, § 24 StVG, 11.3.4 BKat Bearbeitende Dienststelle: Bußgeldstelle Schleswig-Holstein übersandte Anhörung im Bußgeldverfahren “Die Fachanwälte für Verkehrsrecht bei ...Mehr
 Gem. Rade, Rader Hochbrücke A7, km 61.018 in Rtg. Süden
 Gem. Rade, Rader Hochbrücke A7, km 61.018 in Rtg. Süden “Die Fachanwälte für Verkehrsrecht bei der Blitzerkanzlei.de haben diese Messstelle bereits überprüft. Gerne beraten wir Sie umfassend und kostenlos bei Fällen zu dieser Messstelle. Sie wurden hier geblitzt oder gelasert? Dann in nur 2 Minuten kostenlose Beurteilung erhalten.” ...Mehr
 Benutzung eines Mobiltelefons als Führer eines Kraftfahrzeuges wurde mit Bußgeldverfahren verfolgt, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Verbotswidrige Benutzung eines elektronischen Gerätes das der Kommunikation, Information oder Organisation dient oder zu dienen bestimmt ist als Führer eines Kraftfahrzeuges, indem ein Handy in der rechten Hand vor den Körper in Neumünster, auf der A 7, bei km 94,150, in Rtg. Hamburg gehalten wurde. Beweismittel: Zeugen, Foto. Verstoß gegen: § 23 Abs. 1a, § ...Mehr
 Bei zulässiger Höchstgeschwindigkeit von 60 km/h mit 115 km/h in der Gemeinde Borgstedt, auf der Rader Hochbrücke, A 7, bei km 59,485, in Rtg. Norden festgestellt worden, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Bei einer Geschwindigkeitsmessung in der Gemeinde Borgstedt, auf der Rader Hochbrücke, A 7, bei km 59,485, in Rtg. Norden wurde der Geschwindigkeitsverstoß außerhalb geschlossener Ortschaften mit 115 km/h , bei zulässigen 60 km/h gemessen. Die Geschwindigkeitsüberschreitung betrug 55 km/h. Beweismittel:Messung mit Lasergerät und Foto Verstoß gegen: § 41 Abs. 1 iVm Anlage 2, § 49 StVO, ...Mehr
 Durch Lichtschrankenmessung festgestellte Geschwindigkeitsübertretung in Risum-Lindholm, OT Lindholm, auf der Bundesstraße 5 führte zu Bußgeldverfahren, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 In Risum-Lindholm, OT Lindholm, auf der Bundesstraße 5 wurde Geschwindigkeitsverstoß begangen. Die zulässige Höchstgeschwindigkeit innerhalb geschlossener Ortschaften wurde um 24 km/h überschritten. Gemessen wurden 74 km/h mit Lichtschrankenmessung mit Foto, bei zulässigen 50 km/h. Verletzte Vorschriften: § 3 Abs. 3 , § 49 StVO, § 24 StVG, 11.3.4 BKat Aktenführende Dienststelle: Bußgeldstelle Schleswig-Holstein übersandte Formular ...Mehr
 Mit Erhebung von 25,00 € Verwarnungsgeld wurde Geschwindigkeitsübertretung in Kl.-Offeseth, Sparrieshoop, auf der Rosenstraße geahndet, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Es wurde innerhalb geschlossener Ortschaften die zulässige Höchstgeschwindigkeit in Kl.-Offeseth, Sparrieshoop, auf der Rosenstraße um 11 km/h, bei zulässigen 50 km/h überschritten. Festgestellt wurden mit Lichtschrankenmessung und Foto 61 km/h Verletzte Vorschriften: § 3 Abs. 3 , § 49 StVO, § 24 StVG, 11.3.2 BKat Bußgeldstelle Schleswig-Holstein Übersandte Verwarnung / Anhörung „Die Fachanwälte für Verkehrsrecht bei der Blitzerkanzlei.de haben diese Messstelle bereits ...Mehr
 Zulässige Höchstgeschwindigkeit in Dätgen, auf der A 7, bei km 84,340, in Rtg. Flensburg um 22 km/h überschritten, Bußgeldstelle Schleswig-Holstein
 Außerhalb geschlossener Ortschaften wurde in Dätgen, auf der A 7, bei km 84,340, in Rtg. Flensburg, die zulässige Geschwindigkeit überschritten. Dabei betrug die gemessene Geschwindigkeit 82 km/h, zulässig waren 60 km/h. Die Überschreitung von 22 km/h wurde durch Messung mit Lasergerät und Foto dokumentiert. Verstoß gegen: § 41 Abs. 1 iVm Anlage 2, § 49 ...Mehr


text:
Η Βορδόνια είναι ένα μικρό χωριό στο Νομό Λακωνίας, χτισμένο στους πρόποδες του Ταϋγέτου. Μετά την εφαρμογή του νόμου «Καποδίστριας» άνηκε στο δήμο Πελλάνας και αποτελούσε δημοτικό διαμέρισμά του. Πλέον ανήκει στο Δήμο Σπαρτιατών. Παρουσιάζει την ιδιαιτερότητα του επιμερισμού σε έξι συνοικισμούς: τον Κάμπο, τον Όραχο, τη Σουλήνα, τα Παπαδιάνικα, την Άνω Χώρα και τη Λόπεση. Οι συνοικισμοί αυτοί απέχουν 0,5 έως 1,5 χιλιόμετρα περίπου μεταξύ τους. Φημίζεται για το ελαιολαδο που παραγει η περιοχη με πολλες βραβευσεις σε Ελλαδα και εξωτερικο.
 Το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού του χωριού το εγκατέλειψε μετά το Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο, μεταναστεύοντας στην Αθήνα ή σε διάφορες χώρες όπως τις ΗΠΑ, τον Καναδά, την Αυστραλία, τη Γερμανία, κ.α.
 Πληθυσμός
 Άλλα στοιχεία
 Η Βορδόνια τα παλαιότερα χρόνια είχε δύο δημοτικά σχολεία, τα οποία πλέον δεν λειτουργούν λόγω μικρού αριθμού μαθητών. Οι μαθητές του χωριού μετακινούνται στα πλησιέστερα σχολεία στο Καστόρειο, την έδρα του πρώην δήμου Πελλάνας. Η Βορδόνια έχει μία μικρή πλατεία στο συνοικισμό Όραχο, όπου βρίσκεται και η έδρα του δημοτικού διαμερίσματος.
 Η Βορδόνια και οι γύρω περιοχές φημίζονται για την παραγωγή ελαιολάδου. Το ελαιόλαδο που παράγεται στην περιοχή είναι διάσημο λόγω της χαμηλής του οξύτητας, τη βιολογική καλλιέργεια και τη φροντίδα που δείχνουν οι ντόπιοι κατά τη συγκομιδή και επεξεργασία του ελαιόκαρπου.
 Προσωπικότητες
 Παναγιώτης Ζωγράφος, λαϊκός ζωγράφος και αγωνιστής της επανάστασης του 1821.
 Χωριά του νομού Λακωνίας
 Δήμος Σπάρτης


type: contracts

text:
 Avis juridique important
 |
 11992M/PRO/CC/06
 Tratado da União Europeia - Protocolo relativo aos critérios de convergência a que se refere o Artigo 10o9 J. do Tratado que institui a Comunidade Europeia - Artigo 6o
 Jornal Oficial no C 191 de 29/07/1992 p. 0085
 Artigo 6o O Conselho, deliberando por unanimidade, sob proposta da Comissão e após consulta do Parlamento Europeu, do IME ou do BCE conforme o caso, e do Comité a que se refere o artigo 109o-C, aprovará as disposições necessárias à definição pormenorizada dos critérios de convergência a que se refere o artigo 109o-J do presente Tratado, que passarão nessa ocasião a substituir o presente Protocolo.