text:
Perlinių sorų genomo seka suteikia šaltinį agronominiams požymiams gerinti sausringoje aplinkoje gamtos biotechnologijos
 Šio straipsnio „Erratum“ buvo paskelbtas 2018 m. Balandžio 5 d
 Perlinės soros [ Cenchrus americanus (L.) Morrone] yra pagrindinis maistas daugiau nei 90 milijonų ūkininkų sausringuose ir pusiau sausuose Afrikos į pietus nuo Sacharos, Indijos ir Pietų Azijos regionuose. Pateikiame 79 1, 79 Gb juodosios visos genomo sekos etaloninio genotipo „Tift 23D 2 B 1 -P1-P5“, kuriame yra apskaičiuoti 38 579 genai. Mes pabrėžiame didelį vaško biosintezės genų praturtėjimą, kuris gali prisidėti prie šio derliaus toleravimo šilumai ir sausrai. Mes iš naujo nustatėme ir išanalizavome 994 perlinių sorų linijas, leidžiančias sužinoti apie populiacijos struktūrą, genetinę įvairovę ir prijaukinimą. Šiuos sekos sekos duomenis naudojame norėdami nustatyti žymenų bruožų asociacijas genomo atrankai, apibrėžti heterotinius rezervus ir numatyti hibridinį efektyvumą. Mes tikime, kad šie ištekliai turėtų suteikti tyrėjams ir selekcininkams daugiau galimybių pagerinti šį svarbų derlių.
 Manoma, kad iki 2100 m. Pasaulinė temperatūra padidės nuo 1 iki 6 ° C, o tai turės rimtų padarinių žemės ūkiui 1 . Tai reiškia, kad prioritetas yra klimato kaitai tinkamos aprūpinimo maistu užtikrinimo priemonės, ypač atsižvelgiant į tai, kad prognozuojama, jog žmonių populiacija 2050 m. Pasieks 9, 1 milijardo 2 . Kaip vienas sprendimas buvo pasiūlyti pasėliams, pritaikytiems numatomiems aplinkos pokyčiams 3 . Net dabar pasėlių, galinčių atlaikyti klimato pokyčius, prieinamumas ir tolesnis gerinimas galėtų sumažinti 805 milijonų žmonių, kurie nepakankamai maitinasi, alkį, daugiausia gyvenantį besivystančiose šalyse, badą 4 .
 Perlinės soros ( Pennisetum glaucum (L.) R. Br., Sin . Cenchrus americanus (L.) Morrone), C4 žolė, yra labai kryžmai apdulkėjęs diploidas (2 n = 2 x = 14), pasižymintis puikiu fotosintezės efektyvumu ir biomasės gamybos potencialas. Jis auginamas kaip pagrindiniai maisto grūdai ir šiaudų šaltinis pašarams ir degalams Afrikos į pietus nuo Sacharos, Indijos ir Pietų Azijos sausringuose ir pusiau sausuose regionuose. Klimato požiūriu vegetatyvinės, reprodukcinės ir fiziologinės perlinių sorų savybės daro šį augalą gerai tinkamu augti atšiauriomis sąlygomis, įskaitant žemą dirvožemio derlingumą, aukštą dirvožemio pH, aukštą dirvožemio Al 3+ prisotinimą, žemą dirvožemio drėgmę, aukštą temperatūrą, didelį druskingumą ir ribotas kritulių kiekis. Perlų soros patikimai augina grūdus regionuose, kuriuose vidutinis metinis kritulių kiekis siekia tik 250 mm. Tomis pačiomis sausros sąlygomis kukurūzai ( Zea mays ), ryžiai ( Oryza sativa ), sorgas ( Sorghum bicolor ), duonos kviečiai ( Triticum aestivum ) ir kietieji kviečiai ( Triticum durum ) greičiausiai žlugs 5 .
 Perlų soros auginamos 27 mln. Hektarų visame pasaulyje ir yra pagrindinis maistas daugiau nei 90 mln. Skurdo turinčių ūkininkų. Miltiniai grūdai yra labai maistingi, juose yra 8–19% baltymų, mažai krakmolo, daug skaidulų (1, 2 g / 100 g) 6 ir didesnė mikroelementų (geležies ir cinko) koncentracija nei ryžiuose, kviečiuose, kukurūzuose ir sorguose 7 . Svarbu tai, kad šios kultūros reprodukcijos metu gali toleruoti> 42 ° C oro temperatūrą, reiškia, kad ją galima auginti drėkinant labai karštomis šiaurės vakarų Indijos vasaromis 8 .
 Nepaisant aiškios perlinių sorų svarbos žemės ūkyje, šių kuokštelinių augalų derlingumas ir našumas yra labai žemas - vidutinis grūdų derlius siekia tik 900 kg / ha. Taip yra todėl, kad perliniai soros daugiausia auginamos sausomis sąlygomis, kurios yra ribotos gamybos aplinkoje, ir kuo mažiau naudojama komercinių žaliavų, tokių kaip tinkamas drėkinimas, trąšos ir pesticidai. Genetinis pelnas, derlingumo padidėjimas per tam tikrą laikotarpį, per 1996–2013 metus perliniuose sorose buvo vidutiniškai apie 24 kg grūdų / ha per metus Indijoje, kur didžiausias sorų produktyvumas ir pagrindinės perlų soros produkcija. šalys 9 . Perlinės kruopos yra pažeidžiamos keleto lapų ligų, įskaitant pelėsinį pelėsį (kurį sukelia Sclerospora graminicola ), Pyricularia lapų dėmę ar sprogimą ( Pyricularia grisea ) ir rūdis ( Puccinia substriata var. Indica ). Iš tiesų, dėl šių patogeninių infekcijų gali sumažėti derlius ir pablogėti pašarų kokybė. Iki šiol ribotas perlų soros genomikos priemonių pasirinkimas tyrinėtojams ir selekcininkams kliudė naudoti tobulinimo metodus.
 Norėdami pagreitinti perlinių sorų pasėlių gerinimą, mes suklasifikavome visą pamatinio genotipo Tift 23D 2 B 1 -P1-P5 genomą. Mes taip pat iš naujo nustatėme 994 perlinių sorų genotipus, įskaitant 963 inbredų linijas ir pavienius augalus iš kiekvieno iš 31 laukinių prieigų, kad suprastume šio kuokštelinių augalų populiacijos struktūrą, genetinę įvairovę ir prijaukinimą. Mes atlikome viso genomo asociacijos tyrimą (GWAS), kad numatytume derliui būdingus bruožus tiek drėkinamomis, tiek sausros sąlygomis. Taip pat mes naudojome genomo numatymą hibridinio našumo numatymui. Šios programos pabrėžia mūsų sekos sekos duomenų rinkinio naudingumą spartinant veisimąsi ir gerinant genetinį perlų soros augimą.
 Genomo surinkimas
 Norėdami surinkti perlinių sorų genomą, mes panaudojome viso genomo karabino (WGS) ir bakterijų dirbtinės chromosomos (BAC) seką. Dešimt mažų įdėklų (∼ 170, 250, 500 ir 800 bp) ir 13 didelių įdėklų (∼ 2, 5, 10, 20 ir 40 kb) WGS bibliotekų buvo sukonstruotos naudojant Tift 23D 2 B 1 -P1-P5 10 genotipą. . Šios bibliotekos buvo surikiuotos pagal „Illumina HiSeq 2000“ ir buvo sukurti 520 Gb sekos duomenys, atspindintys 296 x genomo aprėptį (1 papildoma lentelė). Iš Tift 23D2B1-P1-P5 buvo pagamintos dvi BAC bibliotekos, kurių vidutinis intarpas buvo ∼ 120 kb, naudojant EcoRI ir HindIII. Iš 100 608 BAC klonų, gavusių × 80 × genomo aprėptį, buvo sugeneruoti 972 Gb sekos duomenys (2 papildoma lentelė ir papildomas 1 pav.). Trumpai tariant, 1, 49 Tb sekos duomenų, atlikus griežtus filtravimo ir korekcijos veiksmus, buvo surinkti į 1, 58 Gb kontingento (sekos be tarpų ar Ns) ir 1, 82 Gb pastolių (kontigai sujungti su įvertintomis spragomis, užpildytomis).
 Remiantis „k-mer“ statistika, perlų soros genomo dydis buvo apskaičiuotas 1, 76 Gb (papildomas 2 pav.), Rodantis, kad surinkti ∼ 90% genomo. Pastoliai, ilgesni nei 1 kb, iš viso sudarė 1, 79 Gb, 50% pastolių (N50) buvo ilgesni nei 884, 95 kb (N50 contig = 18 180 bp), o didžiausių pastolių, apimančių 4, 82 Mb (3 papildoma lentelė). Norėdami įvertinti surinkimą, „PacBio“ platformoje sukūrėme papildomus visos genomo sekos duomenis, 1x aprėptį. Daugiau nei 90% šių ilgų skaitinių buvo sugrąžinti į pastolius, kurių panašumas ir 90% suderinto ilgio santykis buvo didesnis (3 pav.).
 Genominių pastolių surišimas į pseudomoleules buvo panaudotas trijų biparentinių žemėlapių populiacijų sujungimo informacija ir kolinariškumas su lapinės uodegos soros ( Setaria italica ) 11 genomu. Mes surinkome 1, 56 Gb į septynias pseudomoleules (Pg1 - Pg7, 1 pav. Ir 4 papildoma lentelė). Perlinių sorų (47, 9%) vidutinis GC kiekis yra didesnis nei lapinių sorų (46, 1%), sorgo (44, 5%), miežių ( Hordeum vulgare , 44, 4%) ir ryžių (43, 5%) (papildomas 4 pav.). . Įvertinome GC kiekio kintamumą 10 kb apimties nepersidengiančiuose stumdomuose languose (papildomas 5 pav.), Norėdami parodyti, kad stebimas GC kiekis neatsirado dėl sekos nustatymo pagrįstais GC poslinkiais. Taip pat ištirtas GC kiekis viso genomo koduojančioje seka (CDS; 54, 76%) ir 384 išplėstose genų šeimose (53, 14%); jis buvo panašioje proporcijoje kaip bendras genomas, suteikdamas pasitikėjimo šiuo rezultatu (5 papildoma lentelė ir papildoma 6 pav.). Išsamumo analizė buvo atlikta naudojant pagrindinį eukariotinių genų žemėlapių sudarymo metodą (CEGMA), kuris atskleidė, kad surinkime buvo> 97% genų (6 papildoma lentelė).
 Genomo ypatybės 1 Mb intervalu per septynias pseudomoleules. Apskritimo vienetai yra pseudomolekulių megabazių vertės. (1) Pakartokite tankį, (2) Pakartokite tankį, (3) Genų tankį, (4) GC kiekį ir (5) SNP, identifikuotus pakartotinai sekvencizuojant PMiGAP linijas 1 Mb talpyklose. Genomo rinkinyje vidutinis GC kiekis buvo 47, 9% ir jame buvo 38 579 genų modeliai, kurių vidutinis kodavimo sekos ilgis buvo 1 014, 71 bp.
 Pasikartojančios sekos
 Iš viso 1, 58 Gb genomo rinkinyje buvo identifikuota 1, 22 Gb pasikartojančių elementų, tai rodo, kad 77, 2% surinktų genomų yra pasikartojantys. Be to, kadangi pasikartojančios genomo dalys visada yra nepakankamai atstovaujamos genomo rinkinyje, greičiausiai taip pat pasikartos didžioji dalis nesujungtos DNR (0, 18 Gb). Tai nestebina, nes keli pakartojimai dažnai susikaupia į vieną pakartojimą mazge ir taip pat todėl, kad „pakartoti maskavimą“ dažnai atliekamas prieš kai kuriuos surinkimo veiksmus 11, 12, 13 . Mes tikimės, kad tikrasis pasikartojančios DNR procentas bus mažiausiai 80%. Tai yra panaši į pasikartojančių DNR dalį, aptinkamą 2, 3 Gb kukurūzų genome (> 85%), ir žymiai daugiau nei 730 Mb sorge 14 (∼ 61%), ∼ 400 Mb pėdučių soros 11 (∼ 46%). ) arba 466 Mb ryžių 15 (∼ 42%) genomų. Kaip ir daugelio kitų augalų genomų struktūroje, ilgalaikio pakartotinio (LTR) retrotransposonai buvo gausiausia pasikartojančių DNR klasė ir sudaro> 50% perlinių sorų branduolio genomo (7 papildoma lentelė). Naudodamiesi „RepeatMasker“, mes nustatėme, kad ilgų susikertančių branduolinių elementų sekų nukrypimo procentai buvo aukšti (didžiausia - 28%) (papildomas 7 pav.).
 Genai ir anotacija
 Iš viso 69 398 transkriptometru surinkti kontigai (TAC), kurie iš viso sudarė 43 Mb, buvo nustatyti naudojant dviejų skirtingų tyrimų perlinių sorų transkriptų sekas 16, 17 ir šiam tyrimui sugeneruotą naują perlinių sorų transkriptų rinkinį (8 papildoma lentelė). Ab initio homologija paremtas geno numatymas buvo derinamas su nuorašo surinkimu, kad būtų galima daryti išvadą apie nereikalingą 38 579 genų modelių rinkinį, kurio vidutinis nuorašo dydis yra 2420 bp ir vidutinė kodavimo seka 1, 014 bp (1 lentelė; 9 papildoma lentelė). Vidutinis mRNR, CDS, introno ir egzono ilgis perliniame soroje buvo panašus į nurodytą kitų javų genomuose (papildomas 8 pav.). Tarp 458 konservatyviausių genų CEGMA, 437 (95, 4%) genai buvo išbaigti, tačiau 8 (1, 7%) genų nerasta genomo sekoje, 8 (1, 7%) genai nebuvo įtraukti į genų rinkinį, o 5 ( 1, 1%) genų turėjo daugiau nei vieną egzempliorių (galbūt suskaidyti genai). Be to, atlikdami 956 genų palyginimą su universaliųjų vienos kopijos ortologų (BUSCO) analize, mes pažymėjome 96, 7% genų, ir 95, 4% jų yra baigti. Ryžių ir Arabidopsis thaliana genų modeliai buvo komentuojami ir kruopščiai patvirtinami. Norėdami ištirti perlinių sorų genų išsamumą, nusprendėme naudoti ryžių, kurie labiau susiję su perliniu soru nei A. thaliana , genų modelius. 90, 86% iš 4202 ryžių ryžių genų turi homologus perliniuose sorose, o 86% šių perlinių sorų genų buvo visiškai, palyginti su ryžių genų modeliais (perlinių sorų ilgio ir ryžių ilgio santykis 0, 8), atspindintys išsamumą. vienos kopijos genai. Genų tankis padidėjo link pseudomolekulių galų (1 pav.), Tai atitinka visų kitų javų genomų, paskelbtų iki šiol 11, 14, 15, duomenis . Dauguma anotuotų genų koduoja baltymus, homologiškus baltymams, naudojant „SwissProt 18“ (55, 61%) ir „InterPro“ (nuoroda 19) (65, 53%). Funkcijos buvo priskirtos 27 893 (72, 30%) genams, paliekant 10 686 (27, 70%) genus be komentuoto (10 papildoma lentelė).
 Prognozuojami perlinių sorų baltymai buvo palyginti su tais, kurie jau buvo pažymėti dešimtyje augalų rūšių ( Arabidopsis 20, Brachypodium ( Brachypodium distachyon ) 21, bananas ( Musa acuminata ) 22, miežiai 23, lapinių sorų soros 11, kukurūzai 24, ryžiai 15, sorgo 14, sojos pupelės). Daugiausiai ortologų nustatyta, atsižvelgiant į evoliucinį panašumą, didžiausias ortologų skaičius buvo lapinių sorų soruose (74, 16%), mažiausias - Arabidopsis (61, 88%; 11 papildoma lentelė). Abipusis prognozuotų baltymų palyginimas 38 579 perlinių sorų genų modeliuose su 385 891 genų modeliais iš tų pačių dešimties augalų rūšių (kaip aprašyta aukščiau) nustatė 17 949 ortologines grupes (12 papildoma lentelė), iš kurių 5232 turėjo tik vieną perlinių sorų geną, o tai rodo. paprastos ortologijos (13 papildoma lentelė; papildoma 9 pav.). Be baltymus koduojančių genų, mūsų surinkime numatėme 909 tRNR, 235 rRNR, 183 mikroRNR (miRNR) ir 752 mažus branduolinius RNR (snRNR) genus (papildoma 14 lentelė).
 Genų šeimos
 Naudodami OrthoMCL (Ortho Markov klasterio algoritmas //orthomcl.org/orthomcl/) 27, žolių porūšiuose Panicoideae, Pooideae ir Ehrhartoideae nustatėme unikalias ir bendras genų šeimas iš skirtingų rūšių. Perlų soros ir plekšnės soros turi 15 887 genų šeimas (iš jų 14 398 taip pat randamos sorge), o perlų sorose ir miežiuose - 13 607 genų šeimos (2a pav.). Iš viso 15 869 genų šeimos yra bent vienoje rūšyje kiekvienoje iš trijų analizuotų porūšių (ty Panicoideae, Ehrhartoideae ir Pooideae) (2a pav.). 354 genų šeimos buvo iš esmės išplėstos perlų soroje ir sudarytos 1692 genų šeimos (2b pav.). Palyginome vidutinį 384 išplėstų genų šeimų genų ilgį tarp visų dešimties rūšių ir panaudojome „Quantile“ statistikos koncepciją, norėdami įvertinti trumpą CDS. Šioje sąvokoje Q1 yra „25 procentilis“, Q 3 yra „75 procentilis“, o tarpląstelinis intervalas (IQR) įvertinamas kaip Q 3 –Q 1 . Mes manome, kad ilgis, mažesnis nei 1–3 (IQR), yra kraštutinė išimtis. Taikydami šį metodą, mes nustatėme, kad tik 24 (6, 25%) genai turėjo žymiai trumpesnį CDS perlinių sorų genuose, palyginti su kitomis rūšimis. Taigi tik nedidelė dalis išplėstų genų šeimų gali būti neteisingai identifikuotos dėl galimų dalinių genų (papildomas 10 pav.).
 a ) Venno diagramos rodo genų skaičių, pasidalijamą tarp skirtingų žolių rūšių ir tarp žolių šeimų; perlų soros dalijasi 14 398 genais su sorgais ir lapinės soros soromis; 13 027 genai su kukurūzais ir ryžiais; 11 369 genai su miežiais ir kviečiais. b ) 384 genų šeimos yra labai išplėstos, o 1 692 genų šeimos yra susmulkintos perliniuose sorose, palyginti su kitais augalų genomais.
 Genų šeimų išplėtimas ir susitraukimas tarp rūšių taip pat gali paryškinti skirtingų genomų bioinformatikos analizės skirtumus. Dėl skirtingų tyrimų dėl genų modelio identifikavimo paklaidų gali būti sudėtinga palyginti išplėtimą ar susitraukimą. Vienas galimas šališkumo šaltinis yra, jei genas yra suskaidytas, tai yra, visas genas yra anotuojamas kaip du atskiri genai. Remdamiesi eukariotinių ortologinių genų sekomis, mes manome, kad 2, 3% mūsų genų tokiu būdu galėjo būti netinkamai pažymėti (6 papildoma lentelė). Nors mes nustatėme, kad 1692 šeimos buvo sudarytos pagal sutartis su perliniu soru, 5, 4 karto labiau tikėtina, kad susitraukia nei plėtėsi. Vienas paaiškinimas gali būti tas, kad kitų rūšių, kurias mes naudojame palyginimui, referenciniuose genomuose buvo daug didesnė skaldytų genų dalis nei mūsų perlų sorų rinkinyje. Tai padidintų mūsų genų šeimos susitraukimų skaičių.
 Labiausiai išsiplėtusios genų šeimos yra tos, kurios koduoja cutin, suberino, vaško biosintetinius genus ( P <10 –6 ) ir antrinių metabolitų transmembraninius pernešėjus (ABC pernešėjai, P <10 –24 ) (15 papildoma lentelė). Triterpenoidai yra vaško komponentas, be to, mes pastebėjome reikšmingą genų šeimų, susijusių su terpenoidinio stuburo biosinteze, ir monoterpenoidų ( P <0, 05) bei di-terpenoidų biosintezė ( P <0, 005) išsiplėtimą. Pažymėtina, kad padidėjusi kutikulinio vaško sintezė pagerina Arabidopsis rūšių 28 atsparumą sausrai, o sumažėjusi vaško gamyba buvo susijusi su ryžių jautrumu sausrai 29 . Praturtintas genų, skirtų lipidų sintezei ir makromolekulių eksportui iš perlinių sorų, repertuaras gali prisidėti prie jo tolerancijos šilumai ir sausrai.
 Atsparumas patogenams yra lemiamas pasėlių derliaus veiksnys. Daugelyje augalų atsparumo genų yra nukleotidų surišimo vieta (NBS). NBS turinčių genų identifikavimas perlų soroje padės nustatyti galimus atsparumo genus. Po pirminės paieškos rankiniu būdu buvo patikrinti 378 NBS koduojantys genai, turintys ∼ 1% viso genų rinkinio, panašiai kaip ir kituose grūdų genomuose (16 papildoma lentelė). NBS leucino turtingų pakartojimų (NBS-LRR) genai sudarė ∼ 43% NBS genų, tik NBS genai sudarė ∼ 41%. Iš 378 NBS koduojančių genų 360 buvo susieti su vienu iš septynių pseudomolekulių, reikšmingai (Chi kvadrato bandymo P vertė - <10 –10 ) pasiskirstę tarp pseudomolekulių; ∼ 26, 2% ir ∼ 25, 7% buvo atitinkamai Pg4 ir Pg1 (17 papildoma lentelė). Tai taip pat yra tos pačios dvi pseudomolekulės, kurioms buvo priskirtas pelėsinio pelėsio atsparumo kiekybinis bruožo lokusas (QTL) 30 . Mes stebėjome didelius tandeminius NBS genų masyvus netoli Pg1 telomerų srities (dvi 4 genų grupės, keturios 5 genų grupės ir viena 6 genų grupės), po kurių seka Pg4 (trys 2 genų grupės ir dvi 4 genų grupės) ( Papildomas 11 pav. Ir 18 papildoma lentelė), suderinamas su šališku šių lokusų pasiskirstymu ir leidžia manyti, kad tandemo dubliavimasis gali būti svarbus vietinio geno amplifikacijos šaltinis.
 Gyventojų struktūra, įvairovė ir prijaukinimas
 Norėdami geriau išaiškinti populiacijos struktūrą, įvertinti genetinę įvairovę ir suprasti perlinių sorų prijaukinimą, mes iš naujo nustatėme 994 linijas. Iš naujo išrinktas linijas sudarė 260 inbreduotų vyrų sterilumo palaikytojų (B-) ir 320 vyrų vaisingumo atstatymo (R-) linijų, 345 Pearl Millet inbred germplasm Association Association (PMiGAP) linijos (įskaitant auginamus gemalus iš Afrikos ir Azijos, elito patobulintas atviro apdulkinimo kultūras)., hibridiniai tėvų inbredų ir inbredinių kartografinių populiacijų tėvai), 38, 38 inbredinių tėvų kartografijos populiacijos ir 31 laukinių prisijungimų tėvai. Iš viso sugeneravome 1, 16 Tb viso genomo pakartotinio sekvenavimo (WGRS) duomenis, turinčius 1, 68 × aprėptį (∼ 3, 05 Gb vienai linijai) PMiGAP linijose, ir iš viso 116 Gb WGRS duomenis su 1, 86 × aprėptimi (∼ 3, 38 Gb kiekvienoje eilutėje) iš tėvų populiacijų žemėlapių sudarymo linijos (19 ir 20 papildomos lentelės). Be to, naudojant „PMiGAP“ linijas, naudojant genotipizavimą sekos 32 būdu buvo sugeneruota 78, 9 Gb duomenų, kurių vidutinis aprėptis 0, 12 ×, o B ir R linijoms - 614, 45 Gb duomenų, esant 0, 59 × aprėpties, vidutiniškai 1, 06 Gb / mėginys buvo sugeneruotas naudojant RAD seką 33 (papildoma 21 lentelė). Pavieniai augalai iš kiekvieno iš 31 laukinių prieigų, kurių mėginiai ėmėsi Sahelio nuo Senegalo iki Sudano, buvo pakartotinai sekvoduoti, naudojant vidutiniškai 2x aprėptį, naudojant WGRS metodą (22 papildoma lentelė).
 Mes nustatėme 88 256 paprasto sekos pakartojimo (SSR) motyvus, naudodami MI cro SA pasakito programą 34 perlinių sorų genomo sekoje ir sukūrėme pradmenis 74 891 SSR turinčioms sekoms (papildomos lentelės 23 ir 24), kurias gali naudoti perlų soros bendruomenė. genetikai ir veisimui. Remdamiesi sekoskopijos duomenimis, PMiGAP eilutėse nustatėme 29 542 173 vieno nukleotido polimorfizmus (SNP) (25 papildoma lentelė ir išsami informacija apie kartografijos populiacijų tėvus ir hibridines tėvų linijas. Papildomos lentelės 26, 27, 28), 3 844 446 intarpai ir delecijos, mažesnės nei 50 bp (Papildomos lentelės 29, 30, 31) ir 423, 118 genomo masto struktūriniai variantai, didesni nei 50 bp, pvz., Delecijos, dubliavimosi ir intarpai (32 papildomoji lentelė ir papildomi 12–15 pav.). Mes atlikome pagrindinio komponento analizę (PCA) ir sukūrėme kaimynų sujungimo medį, pagrįstą 450 000 aukštos kokybės SNP. PCA analizė ir filogenetinis medis parodė keturis pagrindinius klasterius, iš kurių trys sudarė laukinius prisijungimus, o vienas - sugrupuotą išaugintą daigą (3a, b pav.). Trys laukinės stojimo grupės buvo atskirtos pagal geografinę kilmę į Rytų, Centrinės ir Vakarų Afrikos grupes (3a, b pav.).
 a ) 376 perlinių sorų linijų (345 PMiGAP linijos ir 31 laukinių priedų) pagrindinio komponento analizė naudojant 450 000 aukštos kokybės SNP. Buvo nustatytos keturios skirtingos grupės: kultivuojamos linijos (raudonos) ir laukinės linijos iš rytų (mėlynos), vakarų (oranžinės) ir Centrinės Afrikos (rožinės). b ) Kaimynų sujungimo (NJ) medis, paremtas 450 000 aukštos kokybės SNP. Ši analizė taip pat nustatė atskiras kultivuojamų ir laukinių linijų grupes iš rytinės, vakarinės ir centrinės Afrikos dalių. c ) Laukinių (i, ii) ir kultivuotų prieigų (iii, iv) morfologiniai skirtumai. Laukinėse prieigose yra daugybė žvynuotų žiedyno smaigalių ir mažas sėklų tankis (i), taip pat augalų architektūra, kuriai būdingi daugybė bazinių ir oro šakų (ii), kai augalų aukštis yra apie 1 m. Dirbant su priestatu, sėklos buvo atviros ir didelis sėklų tankis viename smaigelyje (iii), su keliomis bazinėmis šakomis ir be oro šakų (iv).
 Arčiausiai laukinių grupių auginamiems mėginiams yra iš centrinės Vakarų Afrikos dalies (3b pav.), Tai rodo, kad šiame regione atsirado perlinės soros, remiantis ankstesniais tyrimais 35 . Remiantis mūsų genetinėmis analizėmis 36, seniausi archeologiniai liekanos, datuojamos prieš 4500 metų, buvo rastos šiaurės centriniame Sahelyje 36 . Archeologinių liekanų tyrimais nustatyta, kad prieš 3500 metų perlų soros buvo auginamos Sahelio Afrikoje 37, 38, 39 . Perlų sorų žemės ūkio plitimas Azijoje, o ypač Indijoje, taip pat paplitęs prieš 3500 metų 40 . Vidutinė porų nukleotidų įvairovė populiacijose (θ π ) ir Wattersono segregacinių vietų vertintojas (θ indicated) parodė didelę laukinių prisijungimų įvairovę (vidutinė θ π = 0, 00366 ir θ ω = 0, 00342), palyginti su PMiGAP (vidutinė θ π = 0, 00238 ir θ). ω = 0, 00289) ant visų septynių pseudomolekulių (33 papildoma lentelė). Susitarę su PCA analize ir kaimynus jungiančiu medžiu, mes pastebėjome stiprią populiacijos struktūrą laukinėse prieigose ir silpną populiacijos struktūrą PMiGAP linijose (papildomi 16 ir 17 pav.). Silpna auginamų perlinių sorų struktūra rodo vienalytę genetinę įvairovę dideliu geografiniu mastu. Šis modelis neabejotinai yra susijęs su spartiu perlinių sorų žemės ūkio plitimu Afrikoje ir Indijoje be didelių kliūčių difuzijos metu. Tikimasi, kad šio modelio bus kilę iš labai alogamiškų rūšių veislių. Dėl stipraus laukinės įvairovės struktūros ir kultivuojamo mėginio pagrindinės geografinės kilmės matyti, kad Rytų Afrikoje (Sudanas, Čadas) ir Vakaruose (Senegalas, Mauritanija) randamų laukinių populiacijų įvairovė yra nepanaudota ir unikali.
 Patalpinimas perliniuose sorose, kaip kad stebimas 24 kukurūzuose, buvo susijęs su esminiais smaigalio morfologijos ir augalų architektūros pakeitimais (3c pav.). Mes nustatėme kelis genominius regionus, kuriuose buvo sumažinta auginamų (bet ne laukinių) rūšių, kurios gali turėti genus, atrinktus prijaukinimo metu, įvairovė. Naudojant neigiamą kultūrinių (raudonųjų) ir laukinių (mėlynųjų) mėginių įvairovės loginį santykį, vertės, artimos 1, rodo dešimtkartinį įvairovės sumažėjimą, o vertės, artimos 0, rodo, kad kultūriniuose mėginiuose išliko įvairovė. Taip pat mes nustatėme regionus, kuriuose diferenciacija yra didesnė, remiantis fiksacijos indekso (F ST ) matavimu (papildomas 18 pav.). Šios analizės pateikė stačiakampius ir nuoseklius rezultatus ir nustatė 140 genomo regionų, kurių vertės buvo didesnės nei 95% slenksčio tiek įvairovės praradimui, tiek diferenciacijai. Taikant griežtą 99, 5% ribą ir atsižvelgiant tik į abiejų statistinių duomenų nustatytas vertes, 24 genomo regionai sumažino kultūrinio daigumo įvairovę, iš kurių aštuoni buvo Pg7, šeši Pg6 ir penki Pg1 (papildomos lentelės 34 ir 35). . Anksčiau buvo nustatyta, kad 6 ir 7 jungčių grupės turi QTL, kurios paaiškina daugumą fenotipinių skirtumų tarp laukinių ir auginamų perlinių sorų gemalų 41, 42 . Daugelyje nustatytų regionų Tajimos D vertės yra neigiamos (<–2, 0), kas rodo teigiamo atrankos pasirašymą (34 papildoma lentelė). Vienas ryškus daugiau nei dešimtkart didesnės įvairovės praradimo atvejis buvo susijęs su auksino sukelto geno PINOID reguliavimu Pg6. Šis genas yra žinomas kaip nevaisingas žiedynas2 (nuoroda 43) kukurūzuose, o šio geno kitimas buvo susijęs su fenotipiniu žiedyno kitimu 44 . Mūsų analizėje taip pat buvo nustatyti genai, užkoduojantys baltymus, kurie gali būti susiję su morfogeneze (LIM2 ir PINOID Pg6, Myosin 11 Pg7) arba genų reguliavimu (Pagrindinė spiralės – kilpos – spiralė, bHLH110 Pg3, Cinko pirštas Pg6). Norint patvirtinti kiekvieno iš šių genų vaidmenį (-us) prijaukinant, reikės atlikti funkcinę analizę ir atlikti papildomą fenotipo ir genotipo asociacijos analizę, naudojant smulkaus masto QTL metodus.
 Visų genomo SNP duomenys buvo naudojami apskaičiuojant jungčių pusiausvyros irimą (LDD) visuose trijuose gemalų plazmos rinkiniuose. Mes nustatėme r 2 slenkstį kaip 0, 2 ir stebėjome greitą mažesnį kaip 0, 5 kb LDD B ir R linijose (48 bp), taip pat PMiGAP linijose (84–444 bp) (papildomas 19 pav.). Perlinių sorų LDD yra panašus į kukurūzų ir pažymime, kad abu šie augalai yra milžiniški 45 . Tikėtini santykinai greiti LDD eilutėse, atspindinčiose labai algeniškos pandemijos populiacijos pokyčius. Grūdų ir kukurūzų derlius bei jo komponentai yra nepaprastai svarbūs perlinėse sorose ir buvo parinkti prijaukinimo metu. Mes atlikome GWAS per 288 bandomųjų kryžminių palikuonių PMiGAP linijas, kad gautų 20 bruožų, ir nustatėme 1 054 labai reikšmingų žymenų bruožų asociacijas (MTA) 15 požymių (papildoma 36 lentelė): grūdų skaičius kameroje (91 MTA), grūdai kvadratiniame metre (75 MTAs), džiovintuvo sausosios medžiagos išeiga (kg ha -1 ; 5 MTAs), šviežio krosnies derlius (t ha -1 ; 38 MTAs), kultivatoriai augalams (147 MTAs), kameros skersmuo (cm; 1 MTAs), panicle derliaus indeksas (%; 1 MTAs), kameros ilgis (cm, EL; 3 MTAs), kameros derlius (kg / ha; 9 MTAs), kameros skaičius (ha -1 ; 246 MTAs), augalų populiacija (ha -1 ; 68 MTAs), grūdų derlius (kg / ha; 11 MTAs), grūdų derliaus indeksas (%; 5 MTAs), augalų aukštis (cm; 344) ir 1000 grūdų masė (g; 10 MTAs). MTA paaiškino 9–27% fenotipų kitimo (36 papildoma lentelė). Nustatyta, kad atrinkti žymenys, būdingi stresui ir metams, yra svarbūs požymiai, tokie kaip grūdų skaičius kameroje Pg1 ir Pg5 (papildomas 20 pav.). Šie žymekliai gali būti svarbūs perlinių sorų veisimui.
 Genominis hibridinio efektyvumo numatymas
 Mes panaudojome sekoskopijos duomenis, norėdami atlikti genomo atranką, kad nuspėtume grūdų derlių bandomiesiems kryžiams. Ištirti keturi prognozavimo scenarijai, būtent grūdų derlingumas kiekvienoje iš trijų aplinkų (kontrolinis, ankstyvasis ir vėlyvasis stresas) ir skirtingose aplinkose. Mes stebime aukštą numatymo tikslumą, išmatuotą kaip Pearsono koreliacijos koeficientas tarp numatytų ir stebimų verčių, standartizuotas pagal paveldimumo kvadratinę šaknį ( h = 0, 78), kuris yra 0, 6 už efektyvumą įvairiose aplinkose. Tokios rūšies grūdų derlingumo analizė atlikta naudojant kitų genų pasėlių genomo atranką 46 . Neseniai atliktas modeliavimo tyrimas nustatė, kad esant tokiam numatymo tikslumui, genomo atranka galėtų iš esmės pagerinti atrankos prieaugį per metus 47 .
 Mes taip pat numatėme hibridinį našumą, naudodamiesi genomo atrankos strategija, kurioje atsižvelgiama į priedų ir dominavimo efektus. Kraigo regresijos geriausias tiesinis nešališkas prognozavimo metodas 46 buvo mokomas naudojant fenotipinius grūdų derlingumo duomenis iš 64 perlinių sorų hibridų, užaugintų penkiose Indijos aplinkose, pakartotiniuose tyrimuose 2004–2013 m. Grūdų derlingumo duomenys buvo analizuojami naudojant 302 110 SNP, kurių trūkstamos vertės buvo mažesnės nei 5%, o mažesnis alelių dažnis virš 5% - 580 B ir R linijoms (4a pav.). Mes radome 170 perspektyvių hibridinių derinių (papildoma 37 lentelė ir 4a pav.). Iš jų 11 derinių jau buvo panaudoti hibridų, gaunančių geresnį našumą, gamybai (38 papildoma lentelė). Tačiau hibridiniame veisime niekada nebuvo naudojami 159 deriniai (4b pav.), Todėl jie yra tinkami kandidatai auginant didelius derlius hibridus.
 2004–2013 m. Penkiose vietose (Jamnagare, Anandoje, SK Nagare, Mahuvoje, Kotharoje Indijoje) buvo įvertintas 64 skirtingų perlinių sorų hibridų, pagamintų sukryžminus 20 vyriškų ir 23 moteriškų linijų, grūdų derlius. Fenotipų duomenys (1 papildomas duomenų rinkinys) kartu su 302 110 aukštos kokybės SNP žymenų duomenimis, gautais iš 580 B ir R linijų (27 papildoma lentelė), buvo naudojami hibridinių charakteristikų numatymui. Ridžo regresija-BLUP, kurioje atsižvelgiama į priedų ir dominavimo efektus, buvo naudojama hibridiniam našumui numatyti. a ) Prognozavimo tikslumas buvo tiriamas naudojant 500 kryžminio patvirtinimo testų. Kiekviename kryžminiame patikrinime atsitiktinai buvo pasirinkti 48 hibridai kaip treniruočių rinkinys, o likę 16 hibridų buvo naudojami kaip testų rinkinys. b ) Pažadėti hibridiniai deriniai, į kuriuos įeina tėvų linijos, kurie anksčiau nebuvo naudojami veisiant, buvo nustatyti kaip bandymai ir išleidžiami kaip geresni hibridai. c ) Šilumos žemėlapis, kuriame pateikiamos spėjamos heterotinės grupės.
 Mes apžiūrėjome visų galimų 167 910 vieno kryžiaus derinių numatomą hibridinį efektyvumą, taikydami hierarchinį grupavimą kartu su šilumos grafiku, ir ištyrėme šio požiūrio galimybes nustatyti perspektyvias heterotines grupes. Analizės atskleidė dvi linijų grupes, kurių, kaip prognozuojama, hibridų našumas bus vidutiniškai 8% didesnis, kai kertama tarpusavyje, nei bendras 167 910 vieno kryžminio derinio rinkinys (4c pav. Ir papildomas 21 pav.). Šie numatomi didelio derlingumo hibridai galėtų būti naudojami kaip branduolys, norint sudaryti didelio derlingumo heterotines grupes hibridinių perlinių sorų veisimui 48 (papildomos lentelės 37 ir 38).
 Perlų soros yra pagrindinis maistas daugiau nei 90 milijonų žmonių Afrikoje ir Azijoje. Žmonės, gyvenantys sausringuose ir pusiau sausruosiuose regionuose, ypač pasikliauja perlinėmis soromis, kurios gali pasėti atšiauriomis sąlygomis. Mes sekvenavome perlinių sorų geno tipą Tift 23D 2 B 1 -P1-P5 (galima rasti adresu //www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_002174835.1/). Projekto genomo rinkinyje 90% perlinių sorų genomo yra N50 pastolių kaip 884, 95 kb, o 87, 2% genomo surinktas į septynias pseudomoleules. Grūdų rūšių, tokių kaip perlinės soros, turinčios daug pasikartojančių DNR, genomo rinkinys visada yra sudėtingas. Todėl, be WGS metodo, BAC sekų duomenys buvo naudojami kuriant juodraščio genomo rinkinį, o surinkti PacBio duomenys buvo sugeneruoti. Norint pasiekti chromosomos lygio surinkimą, galima naudoti naujus sekos nustatymo metodus, tokius kaip optinis Bionano Genomics žemėlapis ir „Dovetail Genomics“ chromosomų patvirtinimo gavimo duomenys skirtinguose deriniuose 49 .
 Mūsų analizė nustatė 38 579 baltymus koduojančius genus, iš kurių 27 893 (72, 30%) buvo komentuoti. CEGMA ir BUSCO analizė bei palyginimas su ryžių genų modeliais parodė, kad perlų soroje numatyti genai yra išsamūs. Genenų šeimų, susijusių su terpenoidinio stuburo biosinteze ir monoterpenoidų bei diterpenoidų biosinteze genome, išplėtimas gali paaiškinti aukštą perlų soros šilumos ir sausros tolerancijos lygį, palyginti su kitais javais.
 Genomo seka gali suteikti informacijos apie specifinius genominius regionus arba specifinius genus, susijusius su agronomiškai svarbiais bruožais, įskaitant grūdų ir pašarų derlių. Perlinių sorų pašarai yra pagrindinės atrajotojų (ir kitų) gyvulių žaliavos, o veisimas siekiant pagerinti pašarų kokybę ir derlingumą yra nepaprastai svarbus mėsos ir pieno pramonei. Norėdami nustatyti lokusus ar variantus, susijusius su agronominėmis ypatybėmis, mes ėmėmės didelio masto pakartotinio sekos nustatymo pastangų. Atnaujinus PMiGAP rinkinį, paaiškėjo, kad perlų soros evoliucijos metu įvyko nedideli struktūriniai pertvarkymai, tokie kaip įterpimai ir trynimai genome. Tai panašu į stebimus kukurūzus: trečdalis ar daugiau kukurūzų genų atrodo neprivalomi. Dažnas įdėjimas ir pašalinimas kelia rimtų iššūkių pakartotinio sekos nustatymo pastangoms, nes savarankiškai apdulkinančias ir mažo genomo rūšis, tokias kaip ryžiai, lengviau sekti ir analizuoti, palyginti su kryžmai apdulkintomis ir didelio genomo rūšimis, tokiomis kaip kukurūzai, dėl padidėjusio jų genomo struktūrinio kintamumo50. Siekiant sutaupyti išlaidų, tačiau neprarandant informacijos, PMiGAP linijose buvo sugeneruoti 1, 68 × aprėpties WGRS duomenys ir 0, 12 × GBS duomenys, o B ir R linijose - 0, 59 × aprėpties RAD sekos duomenys.
 Genetiškai įvairesnės PMiGAP inbredinės grupės seka bus plačiau naudojama genomo asociacijų žemėlapiams ir alelių gavybai. Visas šias sekas galima rasti //www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/?term=SRP063925. Beveik 1 000 perlinių sorų linijų (963 išaugintų perlinių sorų inbredų ir 31 heterozigotinių laukinių individų, pateiktų //www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/?term=SRP063925) sekvidacijos duomenys suteikia tyrėjams ir selekcininkams didžiulį genomo masto variacijų, įskaitant SNP, indelius, SSR ir struktūrinius variantus, šaltinis (papildomos lentelės 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32) genų, turinčių reikšmingų MTAs, alelių kasymui ir perlų vystymuisi sorų hibridai su padidėjusia heterozė. Mūsų atlikta PMiGAP linijų sekos sekos duomenų analizė kartu su 20 požymių fenotipų nustatymo duomenimis GWAS ir genomo atrankai rodo, kad perlų soroje gali būti įmanoma tuo pačiu pagerinti grūdų ir virimo derlių. Iš tiesų per pastaruosius 50 metų buvo pastebėta geresnių hibridų grūdų ir krosnių derlingumo rodiklių Indijoje, o tai pabrėžia tolesnių patobulinimų potencialą, apie kurį būtų galima sužinoti atlikus mūsų analizę.
 Taip pat parodome genomo sekos ir sekos sekos informacijos naudojimą, kad būtų galima numatyti hibridinio bandymo rezultatus. Ištyrę numatomą 167 910 vieno kryžminio derinio hibridinį efektyvumą, nustatėme 159 linijų poras, kurios iki šiol nebuvo naudojamos hibridiniam veisimui, tačiau gali parodyti aukštą hibridinį efektyvumą. Ši analizės rūšis turi didelį potencialą paspartinti atrankos pelno augimą ateityje. Mūsų prognozavimo modeliai taip pat buvo naudojami apibrėžti perlų sorų heterotinius baseinus Pietų Azijoje, kurie gali būti labai svarbūs didinant hibridinių veisimo programų efektyvumą tame pačiame regione.
 Kartu genomo projektas ir sekos sekos nustatymo duomenys suteikia mokslinių tyrimų bendruomenei išteklių, kurie turėtų padėti geriau suprasti bruožo kitimą ir paspartinti genetinį perlinių sorų gerinimą. Pavyzdžiui, mes nustatėme 1 054 MTA 15 agronominių bruožų, kurie bus naudingi veisiant perlinius sorus. Mūsų išvados taip pat prisidės prie geresnio supratimo apie perlinių sorų išskirtinio sausros ir šilumos tolerancijos genetinius pagrindus, nes nustatėme genų šeimų, susijusių su sausra ir šilumos tolerancija, plėtimąsi. Išsamus supratimas apie perlinių sorų pasėlių naudingumą karštuose, sausringuose ir pusiau sausruosiuose regionuose gali sudaryti sąlygas ne tik perlinių sorų, bet ir kitų javų pasėlių, tokių kaip ryžiai, kukurūzai ir kviečiai, kurie šiuo metu gali parduoti tik ribotą derlių sausosiose vietose, inžinerijai. arba pusiau sausringuose regionuose. Tai ypač svarbu dėl neatidėliotino karščiams ir sausrai atsparių grūdinių kultūrų poreikio ateinančiais metais.
 Perlų soros genotipas Tift23D 2 B 1 -P1-P5 buvo veisiamas Pakrantės lygumų eksperimento stotyje (Tiftonas, Džordžija, JAV), įvedant d2 nykimo geną į elito sėklų tėvų palaikomosios linijos Tift 23B1 genetinį foną ir buvo pasirinktas sugeneruoti genomo sekos juodraštį.
 Norint sudaryti genetinį žemėlapį, skirtą pastoliams suskirstyti į pseudomoleules, buvo naudojamos trys dviejų tėvų kartografijos populiacijos. Šios populiacijos buvo: (i) ICRISAT, Patancheru, sukurta nedidelė rekombinantinių inbredinių linijų (RIL) populiacija, paremta kryžminiu ICMB 841-P3 × ICMB 863B-P2 (MAPPOP1); ii) RIL populiacija, sukurta Coastal Plain Experiment Station, Tifton, Gerogia (JAV), remiantis Tift 99B × Tift 454 (MAPPOP2); ir iii) F 2 populiacija, gauta iš laukinio × naminio kryžiaus (MAPPOP3) iš Prancūzijos Institut de Recherche pour le Developpement (IRD). 580 B ir R linijose buvo 200 B ir 200 R linijų iš ICRISAT ir 60 B ir 120 R linijų iš 5 organizacijų iš Indijos, būtent Haryana žemės ūkio universiteto, Hisar, Haryana; Junagadh žemės ūkio universitetas, Jamnagaras, Gujaratas; Mahatma Phule Krishi Vidyapeeth, Dhule, Maharaštra; Šri Karano Narendros žemės ūkio universitetas, Durgapura, Radžastanas; ir JK Agri Genetics Ltd., Hyderabad, Telangana, buvo pakartotinai sekvenkuoti, naudojant su restrikcijos vieta susietos DNR (RAD) seką (39 papildoma lentelė). PMiGAP linijas sudaro 345 eilutės: 263 sausumos / tradicinės veislės, 46 veisimo linijos, 25 pažengusių / patobulintų veislių ir 11 priestatų, kurių biologinė būklė nežinoma, ir žymi daigumą iš 27 šalių dviejuose žemynuose (40 papildoma lentelė). Šiems 345 prisijungimams buvo taikoma WGRS. Taip pat, naudojant WGRS, buvo pakartotinai nustatyti 38 įbrėžę tėvai, kurie kartografuoja populiacijas, atsiskiriančias nuo sausros, pelėsio ir miltligės (41 papildoma lentelė), ir 31 laukinis stojimas, atstovaujantis septynias šalis (Malis, Mauritanija, Senegalas, Sudanas, Čadas, Malis ir Nigeris). požiūris (42 papildoma lentelė).
 Viso genomo kulkosvaidžių sekos nustatymas ir surinkimas.
 Sukūrėme 10 mažų įdėklų bibliotekų, iš jų 4 su 170 bp įdėklu, 2 su 250 bp įdėklu, 2 su 500 bp įdėklais ir 2 su 800 bp įdėklu ir 13 mate-pair bibliotekų, iš jų 4 su 2 kb įdėklu, 4 su 5 kb įdėklu, 2 su 10 kb įdėklu ir 2 su 20 kb įdėklu ir 1 su 40 kb įdėklu iš perlinių sorų genotipo Tift 23D2B1-P1-P5. Norėdami sudaryti bibliotekas su nuo 170 iki 800 800 bp intarpų, buvo nukirpti aukštos kokybės DNR mėginiai, pataisyti galai ir į 3 'DNR fragmentų galą įpilta' A 'bazių, kad būtų lengviau jungtis prie adapterių. Tinkamo dydžio diapazono fragmentai buvo atrinkti po atskyrimo agarozės gelyje ir amplifikuoti naudojant PGR. Po porų bibliotekų atlikus suskaidymą ir pataisymą buvo atlikta biotinizacijos reakcija. Tada buvo atrinkti reikiamo dydžio DNR fragmentai ir išpjaustyti. Žiedinės DNR buvo susmulkintos į maždaug 400–600 bp fragmentus, o biotinilinti fragmentai buvo paimti, kad būtų galima modifikuoti galą ir adaptuoti ligatūrą, kad būtų sudarytos bibliotekos. Kiekvienai bibliotekai „Illumina HiSeq 2000“ platformoje buvo sugeneruoti suporuoti galiniai skaitymai.
 Norint sukurti BAC biblioteką, DNR iš perlinių sorų Tift 23D2B1-P1-P5 buvo suskaidyta naudojant HindIII ir EcoRI, o po to liguojama į vektorių pCC1BAC. Ligacijos buvo transformuotos į E. coli DH10b šeimininko ląsteles. Po DNR išskyrimo iš BAC klonų, Covaris LE220 sistema buvo panaudota DNR nukirpimui iki 500 bp. Konfigūruoti BAC sekos nustatymui buvo naudojamos „Agilent Bravo“ automatizuota skysčių tvarkymo platforma ir „Agilent BenchCel“ mikroplokštelių tvarkyklė. Tuomet 96-microTUBE plokštelės (Covaris) buvo naudojamos kaip mėginių indai automatizuotam partijos apdorojimui, po to indeksuojant adapterio jungtį ir parinkus dydį 51 . Paprastai BAC dydžiai svyravo nuo 80–180 kb, o sekos fragmentai buvo apie 500 bp. Iš viso buvo sukonstruoti 100 608 BAC klonai, o „HiSeq 2000“ buvo panaudoti kiekvieno BAC klono suporuotų galinių eilių sekai sekti.
 Kiekvienoje bibliotekoje mes filtravome skaitymus, kurie sudarė daugiau kaip 5 procentus „Ns“ arba poliA struktūros, ir taip pat pašalinome skaitymus, kuriuose buvo 20 ar daugiau bazių, kurių kokybės balas buvo mažesnis ar lygus 7. Skaitymas, kai> 10 bp suderintas su adapterio seka (leidžianti ≤ 3 bp nesutapti) buvo laikoma adapterio teršalais ir pašalinta. Be to, buvo pašalintos poros, kurių bendras ilgis buvo mažesnis už bibliotekos įdėklo dydį, leidžiantį 30 bp langą. Mes taip pat apipjaustėme skaitytuvus, jei pagrindų kokybė skaitymo gale ar uodegoje buvo žema.
 k-mer analizė.
 Mes atlikome k-mer analizę 52, norėdami įvertinti perlinių sorų genotipo Tift 23D 2 B 1 -P1-P5 genomo dydį. Genomo dydis buvo apskaičiuotas pagal formulę: Genomo dydis = k-mer_num / Peak_depth, kur k-mer_num buvo bendras k-merų skaičius, o Peak_depth - laukiama k-mer gylio vertė, gauta iš paskirstymo kreivės. K-merų skaičius (paprastai K = 17) buvo apskaičiuotas pagal trumpo fragmento dydį, pateiktą vienos bp skaidrės, ir tada buvo nustatytas kiekvieno k-mer dažnis. Buvo nubraižyta gylio ir dažnio pasiskirstymo kreivė, kurioje x ašis žymi gylį, o y ašis - proporcinį dažnį tame gylyje, padalytą iš bendro visų gylių dažnio.
 Genomo montažo tobulinimas ir tobulinimas.
 WGS surinkimui švarios skaitymo priemonės buvo surinktos naudojant SOAP de novo 53 (2.04 versija) (parametrai: pregraph -s assembly.lib -K 63 -R -d 1 -o pm; contig -g pm pm-R; map-s assembly. lib -g pm -k 45; scaff -g pm). „K-mer“ dažnis seka Puasono pasiskirstymu, kai skaitomas ilgis << genomo dydis 54 . Trumpos intarpų bibliotekos buvo surenkamos į kontigus. Kad būtų galima įvertinti kontūrų persidengimą, parodymai buvo užfiksuoti ant kontigų. „Gapcloser 53“ (versija 1.1, parametras: -a pm.scafSeq.fill -b reads.lib -o pm.scafSeq.fillGap -t 24), esantis SOAP „ de novo“ pakete, buvo naudojamas užpildyti pastolių spragas suporuotų galinių skaitinių pagalba. . Siekiant pagerinti genomo surinkimo kokybę, buvo atlikta 100 608 BAC klonų seka BAC pagal BAC. Kiekvieną sekventuotą BAC surinko atskirai SOAP de novo . Pirmiausia buvo atmestos sekos, trumpesnės nei 2000 bp arba turinčios daugiau nei 30% nežinomų bazių BAC klonuose. Likusios sekos buvo sujungtos su WGS pastoliais kartu, kad būtų pratęstos ir sutrauktos nereikalingos sekos.
 Norint patobulinti WGS pagrįstą surinkimą, BAC sekos duomenys buvo įtraukti į analizę, naudojant 55 triušio paketą. Šį paketą sudaro trys moduliai: „Santykių ieškiklis“, „Persidengimas“ ir „Redundancy Remover“. Pirmajame etape kiekvienos sekos pabaigoje buvo apkirpti 40 bp, nes jie pasirodė esą prastesnės kokybės. Tuomet BLAT 56 aptiko sekų sutapimą, kai minimalus sutapimo ilgis buvo 3000 bp. Antrame pratęsimo modulyje sutapimas, kurio tapatumas didesnis nei 90%, buvo sujungtas ir sekos buvo pratęstos. Siekiant išvengti dubliavimosi galutiniame rinkinyje, segmentiniai dubliavimai ir skirtingi haplotipai buvo identifikuoti ir filtruojami remiantis Puasono pagrindu sukurtu k-mer modeliu, remiantis metodais, aprašytais Liu et al . 52 . Norėdami įvertinti perlinių sorų genomo surinkimą, pirmiausia apskaičiavome BAC sekų ilgį ir N50 pasiskirstymą. BAC ilgis svyravo nuo 80 iki 140 000, o jų N50 buvo nuo 10 iki 40 000 (papildomas 22 pav.). Suskaidytuose BAC agregatuose gali atsirasti spragų, nes poros galo įdėklo dydis yra 500 bp. PacBio rodmenys buvo apdorojami naudojant „Blasr“ (apdorojamą su „PBJelly“ vamzdynu), kad būtų galima įvertinti surinktą seką.
 GBS ir SNP ragina kartoti populiacijas.
 GBS bibliotekos buvo paruoštos naudojant restrikcijos fermentą Ape KI, kaip aprašė Elshire ir kt . 32 . MAPPOP1 ir MAPPOP2 populiacijos buvo seka ties 384 plex (tai yra 384 mėginiai vienoje srautinių ląstelių juostoje) „Illumina HiSeq 2000“, o MAPPOP3 populiacija buvo seka 96 plex (96 mėginiai kiekvienoje tėkmės juostoje). SNP buvo iškviesti naudojant TASSEL-GBS dujotiekį TASSEL v4.1.32 57 . „TASSEL-GBS“ vamzdynas uždirba pridėtinę vertę už kiekvieną atskirai apdorotą pseudomolekulę, todėl tūkstančius atskirų pastolių sujungėme į me 20 megasaflių, kad būtų lengviau skaičiuoti. Skaitymai buvo perdirbti į švarias 64 bp „etiketes“ ir sugretinti su etaloniniais pastoliais naudojant „Bowtie 2“ (nuoroda 58). SNP buvo iškviesti naudojant „DiscoverySNPCallerPlugin“ TASSEL, su minimaliais filtrais, kad būtų sumažintas melagingų teigiamų padarinių dėl sekos klaidų skaičius (mažas alelių dažnis ≥ 0, 01, mažas alelių skaičius ≥ 10, genotipo skambučiai mažiausiai 10% mėginių) (papildomas kodas 1) ).
 RAD seka.
 Kiekvieno B ir R individo genomo DNR buvo suardyta EcoRI. Po elektroforezės norimo ilgio DNR fragmentai buvo išgryninti geliu. Atliktas adapterio ligavimas ir DNR klasterio paruošimas, o fragmentai buvo sekvenuojami „Illumina HiSeq 2000“ platformoje. Panašiai buvo sukonstruotos 29 DNR bibliotekos B ir R linijoms (580 pavyzdžių) ir paeiliui sudarytos naudojant RAD-Seq metodą 33 .
 Genetinio žemėlapio sudarymas.
 SNP, surinkti iš GBS duomenų apie tris populiacijas (MAPPOP1, MAPPOP2 ir MAPPOP3), pirmiausia buvo filtruojami atsižvelgiant į nedidelį alelių dažnį, trūkumą ir heterozigotiškumą (papildomas kodas 2). Ryšio grupės buvo apibrėžtos remiantis hierarchiniu SNP grupavimu ir užsakytos naudojant MSTMap. Kiekvienai populiacijai mes sukūrėme tris žemėlapius: vieną iš griežtai filtruojamų SNP, vieną iš vidutiniškai pateiktų SNP ir vieną, kuriame pateikiamos GBS sekos žymės atgal į griežtai filtruojamą žemėlapį (2 papildomas kodas). Didžiausioje RIL populiacijoje (Tift 99B × Tift 454) sugeneruotas karkaso žemėlapis sudarė pradinį perlinės soros ir plekšnės soros kolineariškumo tyrimą, o gautos palyginamosios žinios buvo panaudotos įtraukiant papildomus pastolius, kuriems ortologija prilygsta pėdų pienių soros genomui. buvo sukurtos naudojant BLASTP (siekiant nustatyti tariamus ortologinių perlinių sorų ir lapių durpių sorų genus, esant E vertės slenksčiui 1e-5) ir MCScanX 59 (mažiausiai penkių sintetinių genų kolineariniams segmentams tarp perlinės soros ir lapinės soros identifikuoti) karkaso žemėlapis. Kiekvieno kryžiaus sugeneruoti genetiniai žemėlapiai ir žemėlapis, kurį mes sukūrėme remdamiesi kolineariškumo informacija tarp perlinės soros ir lapinės soros soros, buvo sujungti naudojant ALLMAPS 60 su didžiausiu svoriu, priskiriamu sintezės žemėlapiui, o po to - griežtiems SNP žemėlapiams, saikingai. filtruoti SNP žemėlapiai ir galiausiai GBS sekos žymės (papildomas kodas 3). Ryšių grupių numeracija buvo priimta pagal esamą konsensuso žemėlapį 17, pagrįstą SSR sekų atvaizdavimu surinktam genomui (3 papildomas kodas).
 Pakartokite anotaciją, genų prognozavimą ir genomo anotaciją.
 Tandemo kartojimų genome ieškojome „Tandem Repeats Finder 61“ (4.04 versija) (parametrai: 2 7 7 80 10 50 2000 -d-h). Perkeliami elementai (TE) buvo identifikuoti genome derinant homologiją ir de novo 62 . For homology-based predictions, we used the repeat database Repbase16.10 63 to identify known repeats in the genome assembly with the program RepeatMasker 64 (Version 3.3.0) (parameter: -nolow -no_is -norna -parallel 1 -lib RepeatMaskerLib.embl.lib). At the protein level, RepeatProteinMask, a software in the RepeatMasker package, was used to perform RMBlast against the TE protein database (parameter: -noLowSimple -pvalue 0.0001). For de novo prediction, the programs RepeatModeler 65 (Version 1.0.5) and LTR_FINDER 66 (Version 1.0.5) were used on the entire genome to generate a pearl millet repeat database, which was subsequently used as input library with RepeatMasker (Version 3.3.0) to identify TEs.
 For predicting genes, we applied several approaches: (i) Homology-based prediction: Proteins previously annotated in other species (Supplementary Table 9) were mapped to the genome using BLAT 56 (Version 34) with default parameters. Alignments in which the coverage of the query protein was less than 0.3 were removed. In addition, if there were multiple BLAT hits (BLAT output was set to the five best hits), secondary hits were removed if their aligned length was less than 0.3 of the aligned length of the top BLAT hit to filter paralogs with lower sequence identity. GeneWise 67 (with parameter -trev -sum -genesf) was used to predict spliced alignments. (ii) De novo gene prediction: AUGUSTUS 68 (Version 2.5.5, –species = maize–uniqueGeneId = true–noInFrameStop = true–gff3 = on–strand = both) and Fgenesh 69 (Version 1.3) were used to detect gene models in the repeat masked genome. (iii) Prediction based on transcript sequences: The assembled transcriptome sequences were aligned to the genome assembly using BLAT (Version 34) using the parameters identity ≥ 0.98 and coverage ≥ 0.98 to generate spliced alignments. (iv) Integration evidence: Source evidence generated from the three approaches mentioned above were integrated using GLEAN 70 to produce a consensus gene set.
 To annotate the function of the final gene models, protein sequences were aligned against KEGG 71 (release 58) and SwissProt 18 (release 20156) with BLASTP (E-value ≤ 1.0e-05) to find the best matches. InterProScan 19 (Version4.8, performed with profilescan, blastprodom, hmmsmart, hmmpanther, hmmpfam, fprintscan and patternScan analysis) was used to identify motifs and domains in the proteins encoded by the gene models along with gene ontology annotations 72 . For ncRNA annotation, tRNA genes in the assembly were identified by tRNAscan-SE 73 (Version 1.23). rRNA genes were aligned with plant query sequences (rRNA from Arabidopsis and rice species) using BLASTN with an E-value threshold of 1.0e-05. Other non-coding RNAs, such as miRNAs and snRNAs were predicted by homology searches against the Rfam database 74 using the INFERNAL 75 (Version 0.81) software.
 The transcriptome sequence data were generated from individuals “9-8” and “3-9” accessions at IRD. Library preparation and sequencing (PE 100 bp) on an Illumina Hi-Seq 2000 platform was performed by Fasteris (Plan-les-Ouates, Switzerland). A total of 81, 207, 232 and 74, 187, 066 sequence reads were obtained for “3-9” and “9-8”, respectively. Adaptor sequences were trimmed and reads were processed for de novo assembly using Velvet 1.0.18 76 and then Oases 0.1.18 77 . Several values of hash length were tested to optimize the assembly: 39, 51, 63, 65, 69 and 73. The obtained assemblies were compared for their ability to map raw reads using BWA 78 . We consequently decided for a hash length of 73. The transcript assembly was then searched for redundancy. Contigs sharing identity over ≥95% of the length of the shortest sequence in a set of putative homologous sequences were clustered. The final transcript assembly contained 50, 313 contigs, with a total of 36, 479, 993 nucleotides. Three transcriptomes (Zeng et al . 16, Rajaram et al . 17, and the transcriptome data generated at IRD, France, available under BioProject ID PRJNA391885) were combined and clustered using CDHIT-EST 79 with default parameters to eliminate redundancy at the sequence level. Then, CAP3 80 was used to assemble the contigs. Ns on either end of the resultant contigs were trimmed. Finally, contigs of at least 200 bp in length were used in gene annotation.
 For gene family analysis, BLASTP with an E-value cutoff of ≤ 1.0e-05 was used to compare all annotated pearl millet protein sequences against a protein data set of 10 sequenced plant species ( Arabidopsis 20, Brachypodium 21, banana 22, barley 23, foxtail millet 11, maize 24, rice 15, sorghum 14, soybean 25 and T. urartu 26 ). The proteins were clustered using OrthoMCL 27 (–mode 3) to define gene families which included both paralogs and orthologs. The number of gene families in each species and genus was calculated based on the composition of the OrthoMCL clusters. Genes that were single copy in an OrthoMCL cluster for all species analyzed were selected to construct a phylogenetic tree using the PhyML (parameters: -d nt -b -4 -m HKY85 -ae -c 4 -te) program 81 (Version 3.0). Divergence times between pearl millet and other species were estimated using MCMCTREE 82 with default parameter. First, the gene family size for each species was calculated based on the output of OrthoMCL, and rooted tree in newick format. CAFE 83 (-p 0.05 -t 4 -r 10000 -filter) was used to predict the expansion and contraction of gene family numbers based on the phylogenetic tree and gene family statistics.
 Population genetic analyses of the PMiGAP lines, including PCA and diversity detection were conducted essentially as described for rice by Xu and colleagues 84 . We used a subset of 450, 000 SNPs, with a missing rate <10% across PMiGAP lines and wild accessions. Briefly, for PCA, eigenvector decomposition of the SNP genotype data was calculated using the R function eigen 85 . A Tracey-Wisdom test with default parameter settings was performed to determine the significance of axes using the twstats program. To build a phylogenetic tree, the percentage of pairwise nucleotide differences between individuals (p-distance) was calculated 85 . The program fneighbor (PHYLIPNEW v3.69.650 within the package EMBOSS v6.6.0.0; parameter: -matrixtype s -treetype n) was used to construct a neighbor joining tree. The resulting tree was edited and visualized using MEGA5 86 by choosing Radiation style. Population structure was assessed using the program Snmf (–k K –c) 87 . Five runs were performed and the values with the smallest Cross-Entropy for K from 2 to 7 were selected to generate the structure graphs. To better assess the structure, we performed the analysis in a geographical context, using TESS3 88 that takes geographical coordinates of the sample into account. Furthermore, parameters of population genetic diversity π, θ ω and differentiation (F ST ) were calculated based on the SNP data as described earlier 85 . To analyze diversity across the genome, we used a window of 100 kb and calculated the diversity π, θ ω and differentiation F ST for each window for PMiGAP lines and wild accessions using BioPerl modules (Bio::PopGen::Statistics and Bio::PopGen::PopStats) on a sliding window of 100 kb using genotype data. The effective sequence length (without Ns) in each window was used as the denominator to calculate per-bp values. We then calculated a minus log of the ratio of diversity between cultivated and wild samples: –log (π cultivated/ π wild). For this log ratio of diversity and differentiation, we retained the most extreme values using a classical threshold of 95% for a unilateral test and a more stringent threshold of 99.5%. This later stronger stringent threshold was used to identify the most likely gene candidates selected during domestication. Loci with higher levels of differentiation (most extreme F ST ) and stronger loss of diversity in the cultivated compared to the wild accessions were considered to be provisionally involved in the domestication process.
 All pearl millet proteins were assessed for the presence of NBS domains (PF00931, NB-ARC) using the Hidden Markov Model based method implemented in hmmsearch (version 3.0) 89 with an e-value cutoff = 1. To filter false positive hits, all identified NBS containing proteins were screened against the Pfam-A database. NBS domains that overlapped with other domains identified at lower e-values were filtered out. Likewise, the TIR domain (PF01582) was used as query against all pearl millet proteins with hmmsearch and further checked by looking at the overlapping domains. To detect LRR motifs, predicted NBS encoding proteins were searched against 10 LRR families in LRR clan (CL0022) with an e-value cutoff = 1. All regions predicted as LRR motifs and not overlapping with other domains identified with lower e-values were considered real LRR motifs.
 Sequence reads generated for the B- and R- lines, PMiGAP lines, and parental lines and wild lines were mapped separately to the pearl millet genome assembly using BWA (v0.6) (parameter: aln -n 0.04 -o 1 -e 30 -i 15 -d 10 -l 35 -k 2 -m 2000000 -t 4 -M 3 -O 11 -E 4 -R 30 -q 0 -I; sampe -a 500 -o 100000 -n 3 -N 10 -c 1.0e-05). The BAM files generated by BWA were sorted and provided as input to the GATK software package 90 (Version 3.1-1). The UnifiedGenotyper module within GATK was used to detect SNP variants. The variants were filtered using VariantFiltration, a module from GATK (parameters: QD60.0 || MQ13.0; parameters for indel: QD200.0), and the number of variants distribution in intergenic/coding regions were calculated. The data used in the downstream analysis were controlled with MAF 0.05 and missing rate 0.5. SNPs with a mean depth > 100 and missing rate > 0.5 were removed. The remaining SNPs were used in further analyses. Variants for wild lines that used in population structure and domestication analysis were detected together with PMiGAP accessions and processed with the same strategy (BAM and VCF files available at //ceg.icrisat.org/ipmgsc/).
 The BAM files from each resequenced accession was analyzed by Breakdancer (version 1.1.2) 91 with default parameters to detect structural variation namely, deletions, insertions, inversions, and intra-chromosomal translocations. Breakdancer results of accessions that come from a same line (see Supplementary Table 32) were combined to remove redundancy and to calculate the number and length of the rearrangements.
 Using SNP data sets from PMiGAP lines, Haploview software 92 (-maxdistance 250 –minMAF 0.05 -dprime -memory 5096) was used to calculate correlation coefficient ( r 2 ) values for LD. The average ( r 2 ) values between pairwise distances (bp) were calculated and figures were plotted using R.
 The three test environments consisted of early-onset of stress, late-onset stress, and a common, fully-irrigated non-stress treatment. Drought stress was imposed by withholding irrigation from about one week before flowering in early-onset treatment, while drought stress in the late-onset treatment was imposed by withholding irrigation from 50% flowering. Data were recorded for a total of 20 traits namely, grain yield (GYHA), panicle yield (HYHA), panicle harvest index (PHI), time to 75% flowering (TB), plant height (PH), panicle length (EL), panicle diameter (ED), panicle number (HCHA), number of tillers per plant (Till), biomass yield (BM), grain harvest index (HI), thousand grain weight (TGW), grain number per panicle (GNP), grain number per m 2 (GNM2), agronomic score (AgS), stover dry matter fraction (DMF) and vegetative growth index (GI). PH, EL, and ED were measured on the main stems of five representative plants of each entry in a plot at maturity. At harvest, data were recorded from the harvested area on plant population (PCHA), panicle numbers (HCHA) and fresh stover yield (FSWTHA). Effective tiller number (Till) was calculated as the ratio HCHA/PCHA. HYHA, GYHA and TGW were recorded after oven drying for about 24 h. Stover dry matter yield (DMY) was estimated from plot FSWTHA using the fresh and dry weights of a chopped subsample of stover from each plot. BM was calculated as HYHA + DMY on a plot basis. Grain number per panicle (GNP) was derived from primary data as [(GYHA/HCHA)/ (TGW/1000)]. Grain harvest index was calculated as the ratio between grain yield and biomass yield at harvest, and panicle harvest index as the ratio between grain weight and panicle weight. Flowering time was recorded as days from seedling emergence to stigma emergence for 75% of the main shoots in a plot. The traits measured include grain yield (kg/ha), panicle yield (kg/ha), panicle harvest index (%), time to 50% flowering (number of days), plant height (cm), panicle length (cm), panicle diameter (cm), panicle number, tillers per plant, biomass yield (kg/ha), vegetative growth index (kg/ha/day), grain harvest index (%), fresh stover yield (t/ha), stover dry matter yield (kg/ha), stover dry matter fraction, 1000-grain mass (g), grain number per panicle, and grain number per m 2 (Supplementary Data set 2). Analysis of variance for all traits was performed using the PROC MIXED procedure in SAS 9.3 (SAS Institute Inc 2013) with Kenward-Roger degree of freedom approximation method considering replicates and accessions as fixed effects, whereas incomplete blocks within each replication were considered as random effects for combined intra and inter block analysis. Best linear unbiased estimates (BLUEs) were calculated for all accessions.
 For GWAS analysis, a total of 3, 117, 056 SNPs retained after filtering the minor alleles (MAF<0.05) and 20% missing data were used. Marker-trait associations were established using AOV model with a bloc effect for maturity group in R (Phenotype ∼ Bloc+SNP). We tested the suitability of the model by plotting the observed P-values from the association test against an expected (cumulative) probability distribution. These quantile-quantile (qq) plots clearly indicated that we corrected properly for population stratification (Supplementary Fig. 23). Significance of associations between loci and traits were determined adjusting for multiple testing by using FDR at a 0.001 threshold level and considering p value lower than 10 −10 .
 The heritability on the line mean basis was estimated as
 are variance components arising from genotype, genotype × year interaction, genotype × stress interaction, the three-way interaction and the residual, respectively. y , s and r are the number of different years, stresses, and replications. In addition, we calculated the BLUE for each genotype in each environment (stress versus control) across years. That is, for each environment we fitted a linear mixed model including genotype, flowering time, year, genotype × year interaction, replication, incomplete block and residual effects. The assumptions of the parameters were similar to above. The heritability in this case was estimated as
 All phenotypic data analyses were done using the ASreml- R 3 software 93 .
 A total of 2, 235, 060 SNPs with <20% missing rates were used with above mentioned phenotyping data for genomic prediction analysis. We used the genomic best linear unbiased prediction (G-BLUP) model for genomic selection:
 , where y refers to n -dimensional vector of phenotypic records, 1 n is an n -dimensional vector of ones,
 is the mean, g is an n -dimensional vector of additive genotypic values and e is an n -dimensional vector of residual terms.
 is a fixed parameter, and g , e are random parameters with
 , where G denotes the n × n genomic relationship matrix. G was calculated as follows: Let X = ( x ij ) be the n × p matrix of SNP markers, where x ij equals the number of a chosen allele at the j th locus for the i th genotype. Let p j be the allele frequency of the j th marker. W = ( w ij ) is an n × p matrix with w ij = x ij − 2 p j .
 Tada mes turime
 Note that when calculating the kinship coefficient for two genotypes, only those markers without missing values in both genotypes were considered.
 The accuracy of genomic prediction was evaluated by fivefold cross-validation with a total of 100 cross-validation runs. The cross-validated prediction accuracy was calculated as the Pearson product-moment correlation between predicted and observed genotypic values of the lines in the test set. The GBLUP model was implemented using the R software 94 .
 Yield ∼ Genotype + Replication.
 To estimate variance components, all effects were treated as random. The BLUEs for each environment were calculated by the same mixed model but modelling genotype as fixed effect. Repeatability was estimated as
 , where N R refers number of replications,
 refers to genetic variance, and
 refers to residual variance. Four environments with repeatability lower than 0.5 were removed from further analysis. The BLUEs of the 64 hybrids of each environment were used for an analysis across environments by fitting following model:
 Yield ∼ Genotype + Environment.
 The genotype effects were treated as fixed and the environment effects as random. The distribution of the BLUEs across environments approximated a normal distribution. The variance components of genotypes
 , genotype x environment interactions
 and of the residuals
 were estimated using a one-step model. Broad-sense heritability was then calculated as the ratio of genotypic to phenotypic variance:
 where l refers to the number of environments and r is the average number of replications per environment. The hybrid prediction was based on 302, 110 high-quality SNP markers obtained from 580 B- and R- lines. We used ridge regression-BLUP considering additive and dominance effects to predict the hybrid performance. Details of the implementation of the models have been described earlier 95 . Briefly, the general form of the model is defined as the following:
 where 1 n is a vector of ones and n is the number of hybrids, μ refers to the overall mean across all four locations. Z A and Z D are n × m design matrices for the additive and dominance effects of the markers, where m refers to the number of markers. The elements of Z A are -1, 0, 1, and elements of Z D is 0, 1. While a = ( a 1, a 2, ..., a m ) T and d = ( d 1, d 2, ..., d m ) T are the vectors of length m, and a i d i denote the additive and dominance effects for the i th marker, respectively. e = ( e 1, e 2, ..., e n ) T is a vector of length n and e j is the residual for the j th hybrid.
 Prediction accuracy was studied using cross validations. In each cross validation, 48 hybrids were randomly selected as training set and the remaining 16 hybrids were used as test set. The cross validation was run 500 times and accuracy was estimated as the Pearson correlation coefficient between predicted and observed values standardized with the square root of the heritability (h = 0.76). Next, we used all 64 hybrids as a training set and predicted the hybrid performance of 167, 910 possible single-cross combinations among the 580 inbred lines (260 B-lines and 320 R-lines). Based on the predicted values, we selected 0.1% hybrids that had the highest predicted yields (170/167, 910 hybrids). Of those 170 hybrids, 11 have been bred so far and are thus a subset of the 64 phenotyped hybrids. The remaining 159 hybrids are based on parental inbred lines that have never been used for hybrid breeding and could be tested in the field. All analyses were done using the ASreml-R 3 software 93 .
 Genome sequence assembly and annotation data: BioProject ID PRJNA294988; BioSample ID SAMN04124419. Resequencing data: SRA SRP063925. Transcriptome data: BioProject ID PRJNA391885. BAM and SNP files are available at //ceg.icrisat.org/ipmgsc. GigaScience Database record: //dx.doi.org/10.5524/100192 Scripts used in the MS are available at //github.com/ICRISAT-CEG/PM-Scripts.git
 BioProjektas
 19 papildoma lentelė
 2 papildomas duomenų rinkinys
 Ištyrus 22 genų, dalyvaujančių PI3K – AKT kelyje, profiliavimą, išskiriami du aukštos klasės endometriumo karcinomų, turinčių skirtingus molekulinius pakitimus, pogrupiai.
 Metforminas stimuliuoja IGFBP-2 geno ekspresiją per PPARalfa, esant diabetui
 Su amžiumi susijęs humorinio atsako į gripą susilpnėjimas yra susijęs su antigeno specifinių T folikulų pagalbininkų ląstelių reakcijų pokyčiais.


type: wikipedia

text:
Tá an Dochtúir Val Noone ar dhuine de na scoláirí is mó a rinne taighde ar stair na nÉireannach san Astráil, agus tá suim ar leith aige i stair na Gaeilge sa tír sin. Tá mórán foilsithe aige agus is minic é ina chainteoir ag ócáidí léinn san Astráil agus sa Nua-Shéalainn.
 Tá an Dr Noone ina chomhalta onórach den Roinn Staire in Ollscoil Melbourne in Victoria. Ghnóthaigh sé céim sa léann Bíoblach, san fhealsúnacht agus sa diagacht i gColáiste Corpus Christi in Melbourne, agus rinne sé taighde dochtúireachta ar thuairimí lucht creidimh faoin gcogaíocht. Thug sé tamall maith ina shagart Caitliceach, agus tá suim aige fós i gcúrsaí sóisialta na hEaglaise.
 Tá baint aige le Cumann Gaeilge na hAstráile, agus anuas go dtí an bhliain 2007 ba é eagarthóir Táin (iris an Australian Irish Network) é.
 Tá mórán taighde déanta aige ar stair na Gaeilge i Stát Victoria go háirithe. Tá roinnt páipéar scríofa aige faoin ábhar seo, in éineacht le halt a chomhscríobh sé don iris Feasta ar an Dochtúir Nioclás Ó Domhnaill, athbheochanóir nótáilte Gaeilge in Melbourne i dtús an 20ú haois. Ar na saothair is tábhachtaí agus is bunúsaí dá chuid tá Hidden Ireland in Victoria, stair na Gaeilge in oirdheisceart na hAstráile.
 Bronnadh Ord na hAstráile air sa bhliain 2009.
 I 2013 bhronn Ollscoil Náisiúnta na hÉireann Céim Dhoctúir Litríochta honoris causa air de bharr a ndearna sé ar son an léinn Éireannaigh san Astráil.
 Rogha foilseachán
 'Nioclás Ó Domhnaill: Laoch na Gaeilge san Astráil' (le Colin Ryan) in Feasta, Bealtaine 2009
 'Ór agus Adhmad: Éireannaigh Bungaree' (le Mary Doyle agus Colin Ryan) in Feasta, Márta 2012.
 'An Irish Rebel in Victoria: Charles Gavan Duffy, Selectors, Squatters and Aborigines' in Echoes of Irish Australia - Rebellion to Republic, J. Brownrigg, C. Mongan, R. Reid (eds.), National Library of Australia (Canberra) 2007
 'Michael Davitt, Melbourne and the Labour Movement', in Australian Journal of Irish Studies, Vol. 6, lgh 25-42
 'Printers and New Technology around 1980: an Age Proof Reader's View' in The Time of Their Lives - The Eight Day and Working Life, J. Kimber, P. Love (eds.), Australian Society for the Study of Labour History (Canberra) 2007
 Disturbing the War: Melbourne Catholics and Vietnam, Melbourne, Spectrum 1993
 Hidden Ireland in Victoria, Ballarat Heritage Services 2012
 Féach freisin
 An Ghaeilge san Astráil
 Eoghan Ó Riain
 Niall Ó Ciosáin
 Nicholas M. Wolf
 Nioclás Ó Domhnaill
 Séamas Ó Duibhir
 Tagairtí
 Scoláirí Gaeilge
 Daoine Astrálacha


type: contracts

jurisdiction: EU

text:
 Avis juridique important
 |
 22003D0144
 Decisión del Comité Mixto del EEE n° 144/2003, de 7 de noviembre de 2003, por la que se modifica el anexo II (Reglamentaciones técnicas, normas, ensayos y certificación) del Acuerdo EEE
 Diario Oficial n° L 041 de 12/02/2004 p. 0027 - 0028
 Decisión del Comité Mixto del EEEno 144/2003de 7 de noviembre de 2003por la que se modifica el anexo II (Reglamentaciones técnicas, normas, ensayos y certificación) del Acuerdo EEEEL COMITÉ MIXTO DEL EEE,Visto el Acuerdo sobre el Espacio Económico Europeo, adaptado por el Protocolo por el que se adapta el Acuerdo sobre el Espacio Económico Europeo, en lo sucesivo denominado "el Acuerdo", y, en particular, su artículo 98,Considerando lo siguiente:(1) El anexo II del Acuerdo fue modificado por la Decisión del Comité Mixto del EEE n° 108/2003, de 26 de septiembre de 2003(1).(2) Debe incorporarse al Acuerdo el Reglamento (CE) n° 61/2003 de la Comisión, de 15 de enero de 2003, que modifica los anexos I y II del Reglamento (CEE) n° 2377/90 del Consejo por el que se establece un procedimiento comunitario de fijación de los límites máximos de residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos de origen animal(2).DECIDE:Artículo 1En el punto 14 [Reglamento (CEE) n° 2377/90 del Consejo] del capítulo XIII del anexo II del Acuerdo se añadirá el guión siguiente:"- 32003 R 0061: Reglamento (CE) n° 61/2003 de la Comisión, de 15 de enero de 2003 (DO L 11 de 16.1.2003, p. 12).".Artículo 2Los textos del Reglamento (CE) n° 61/2003 en lenguas islandesa y noruega, anejos a las respectivas versiones lingüísticas de la presente Decisión, son auténticos.Artículo 3La presente Decisión entrará en vigor el 8 de noviembre de 2003, siempre que se hayan transmitido al Comité Mixto del EEE todas las notificaciones previstas en el apartado 1 del artículo 103 del Acuerdo(3).Artículo 4La presente Decisión se publicará en la sección EEE y en el suplemento EEE del Diario Oficial de la Unión Europea.Hecho en Bruselas, el 7 de noviembre de 2003.Por el Comité Mixto del EEEEl PresidenteH. S. H. Prinz Nikolaus von Liechtenstein(1) DO L 331 de 18.12.2003, p. 20.(2) DO L 11 de 16.1.2003, p. 12.(3) No se indican requisitos constitucionales.


type: caselaw

text:
 2.3.2015
 RO
 Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
 C 73/45
 Recurs introdus la 31 decembrie 2014 de Carlo De Nicola împotriva Hotărârii din 11 noiembrie 2014 a Tribunalului Funcției Publice în cauza F-55/08 RENV, De Nicola/BEI
 (Cauza T-848/14 P)
 (2015/C 073/56)
 Limba de procedură: italiana
 Părțile
 Recurent: Carlo De Nicola (Strassen, Luxemburg) (reprezentant: L. Isola, avocat)
 Cealaltă parte din procedură: Banca Europeană de Investiții
 Concluziile
 Recurentul solicită Tribunalului:
 Admiterea prezentului recurs și modificarea în parte a hotărârii atacate, în sensul înlăturării referirii la articolul 270 TFUE, anulării punctelor 2 și 3 din dispozitiv și a punctelor 16, 17, 18, 19, 22, 37, 41, 42, 45, 47, 48, 49, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 și 66 din motivare. Trimiterea cauzei unei camere diferite a TFP pentru ca, într-o compunere diferită, să decidă din nou cu privire la punctele anulate cu admiterea în prealabil a măsurilor de cercetare judecătorească solicitate. Își rezervă dreptul de a solicita administrarea oricărei probe, directă și/sau contrară, care va fi necesară în funcție de apărarea intimatei, precum și de a depune orice alte înscrisuri apreciate utile în vederea infirmării susținerilor părții adverse. Cu cheltuieli de judecată.
 Motivele și principalele argumente
 Prezentul recurs are ca obiect Hotărârea Tribunalului Funcției Publice din 11 noiembrie 2014, pronunțată în cauza F-55/08 RENV, De Nicola/BEI.
 În susținerea recursului, recurentul invocă următoarele motive:
 1.
 Omisiunea de a se pronunța asupra cererii de înlăturare a observațiilor și a înscrisurilor BEI;
 2.
 Omisiunea de a se pronunța asupra recuzării președintelui completului de judecată;
 3.
 Greșita interpretare a hotărârii în cauza T-37/10 P;
 4.
 Nemotivarea sau motivarea netemeinică cu privire la aprecierea hărțuirii morale și obligarea la încetarea acesteia;
 5.
 Comitetul de recurs va trebui să se pronunțe pe fond în ceea ce privește raportul de evaluare 2006;
 6.
 Existența unui interes la pronunțarea asupra anulării promovărilor pentru anul 2007, pentru a evita ca acestea să devină definitive.


text:
 Svarīgs juridisks paziņojums
 |
 21999D0182
 Oficiālais Vēstnesis L 074 , 15/03/2001 Lpp. 0010 - 0010
 EEZ Apvienotās komitejas LēmumsNr. 182/1999(1999. gada 17. decembris),ar kuru groza EEZ līguma XIII pielikumu (Transports)EEZ APVIENOTĀ KOMITEJA,ņemot vērā Eiropas Ekonomikas zonas līgumu, kas grozīts ar protokolu, ar kuru pielāgo Eiropas Ekonomikas zonas līgumu, še turpmāk "Līgums", un jo īpaši tā 98. pantu,tā kā:(1) EEZ Padomes 1995. gada 10. marta Lēmumā Nr. 1/95 par Eiropas Ekonomikas zonas līguma spēkā stāšanos attiecībā uz Lihtenšteinas Firstisti [1] ir paredzēts, ka Lihtenšteinai no 2000. gada 1. janvāra jāīsteno Līguma XIII pielikuma VI nodaļā (Civilā aviācija) minētie tiesību akti, ko 1999. gadā pārskata EEZ Apvienotās komiteja;(2) EEZ Apvienotā komiteja, saskaņā ar Līguma XIII pielikuma VI nodaļu (Civilā aviācija) veicot pārskatīšanu, ir secinājusi, ka īpašie apstākļi Lihtenšteinā, kas pamato pārejas laika izmantošanu, nav mainījušies;(3) pamatojoties uz to, ir lietderīgi pārejas laiku pagarināt līdz 2002. gada 1. janvārim,IR PIEŅĒMUSI ŠĀDU LĒMUMU.1. pantsLīguma XIII pielikuma VI nodaļā (Civilā aviācija) starp nodaļas virsrakstu un apakšvirsrakstu esošo tekstu "i) Konkurences noteikumi" aizstāj ar šo:"Lihtenšteina no 2002. gada 1. janvāra īsteno zem ii) līdz vi) apakšvirsraksta minēto tiesību aktu noteikumus, ko 2001. gadā pārskata EEZ Apvienotā komiteja."2. pantsŠis lēmums stājas spēkā 2000. gada 1. janvārī ar nosacījumu, ka EEZ Apvienotajai komitejai ir iesniegti visi paziņojumi saskaņā ar Līguma 103. panta 1. punktu.3. pantsŠo lēmumu publicē Eiropas Kopienu Oficiālā Vēstneša EEZ iedaļā un EEZ papildinājumā.Briselē, 1999. gada 17. decembrīEEZ Apvienotās komitejas vārdā —priekšsēdētājsN. v. Liechtenstein[1] OV L 86, 20.4.1995., 58. lpp.--------------------------------------------------


type: other

text:
RV/0213-I/04-RS1
 Dem durch die gegenständliche Erhöhung des Stammkapitals aus Gesellschaftsmitteln verwirklichten Steuertatbestand nach § 2 Z 1 KVG steht nicht der Artikel 4 Abs. 1 lit c der Kapitalansammlungs-RL entgegen, wird doch in wirtschaftlicher Sicht dieser Grundtatbestand der Kapitalansammlungs-RL durchaus erfüllt. Außerdem wird durch Art. 4 Abs. 2 lit. a der Kapitalansammlungs-RL ausdrücklich normiert, dass eine solche Erhöhung des Stammkapitals einer GmbH durch Umwandlung von Gesellschaftsmitteln (Gewinnvortrag, Rücklagen) in Stammkapital "weiterhin der 1 % Gesellschaftsteuer unterworfen werden kann". Der eingewendete Konflikt zwischen dem Gemeinschaftsrecht und der nach § 2 Z 1 KVG vorzunehmenen Besteuerung einer Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln liegt folglich nicht vor. Es wurde daher dem Antrag auf Erstattung der selbst berechneten Gesellschaftsteuer zu Recht nicht entsprochen. Zusatzinformationen betroffene Normen:
 Der unabhängige Finanzsenat hat über die Berufung der F.GmbH., Adresse, vertreten durch Steuerberatungsgesellschaft, vom 19. Dezember 2003 gegen den Bescheid des Finanzamtes Innsbruck vom 11. Dezember 2003 betreffend Abweisung eines Antrages auf Erstattung der selbst berechneten Gesellschaftsteuer gemäß
 § 10a Abs. 7 KVG entschieden: Die Berufung wird als unbegründet abgewiesen. Der angefochtene Bescheid bleibt unverändert. Entscheidungsgründe
 Laut notariellem Protokoll über die am 22. Jänner 2003 abgehaltene Generalversammlung wurde unter dem Tagungsordnungspunkt 4 ua. der Beschluss auf Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln gefasst. Dieser Beschluss hatte folgenden Wortlaut: "Gleichzeitig wird das Stammkapital von € 36.336,41/ Euro sechsunddreißigtausenddreihundertsechsunddreißig/41/ um € 763.663,59/Euro siebenhundertdreiundsechszigtausenddreihundertdreiundsechzig/59/ auf € 800.000,00/Euro achthunderttausend/ unter Heranziehung von Gesellschaftsmitteln erhöht. Hiezu wird festgehalten, dass der der Kapitalberichtigung zu Grunde liegende Jahresabschluss per 30.04.2002/dreißigsten April zweitausendzwei/ im Zuge der heutigen Generalversammlung (zum ersten Tagungsordnungspunkt) festgestellt wurde.
 Die Kapitalerhöhung erfolgt unter Heranziehung des in diesem Jahresabschluss ausgewiesenen Gewinnvortrages in Höhe des beschlossenen Erhöhungsbetrages rückwirkend zum Bilanzstichtag.
 Der Erhöhungsbetrag wächst den Gesellschaftern im Verhältnis ihrer Anteile am bisherigen Stammkapital rückwirkend zum Bilanzstichtag zu. Auf den Gesellschafter F.F. entfällt somit eine Stammeinlagenerhöhung im Betrag von € 190.915,90/Euro einhundertneunzigtausendneunhundertfünfzehn/90/, auf die Gesellschafterin H.F. eine solche in Höhe von € 420.014,97/Euro vierhundertzwanzigtausendnullvierzehn/97/, und auf den Gesellschafter F.J.F. eine solche in Höhe von € 152.732,72/Euro einhundertzweiundfünfzigtausendsiebenhundertzweiunddreißig/72/.
 Hinsichtlich der auf Grund der beschlossenen Kapitalerhöhung sich nunmehr ergebenden Verhältnisse der mit der Stammeinlage verbundenen Rechte zueinander, sowie der Stimmrechte wird ebenfalls auf die diesem Protokoll angeschlossene und zuvor erwähnte Darstellung (Beilage./2) verwiesen.
 Die Gesellschafter beschließen im Hinblick auf die zuvor beschlossene Kapitalerhöhung weiters einstimmig die Änderung des Gesellschaftsvertrages im folgenden Punkt, sodass diese Bestimmung in Hinkunft wie folgt zu lauten hat:
 Für diese Kapitalerhöhung wurde am 23.01.2003 zu Erfnr. xxxxx von NotarX die Gesellschaftssteuer selbstberechnet. Mit Schreiben vom 21. Februar 2003 stellte die F.GmbH (im Folgenden: Bw) den Antrag gemäß
 § 10a Abs. 7 KVG auf Rückerstattung der im Wege der Selbstberechnung entrichteten Gesellschaftsteuer von € 7.636,64. Begründet wurde dieser Antrag mit dem Vorbringen, die Rechtsgrundlage für diese Vorschreibung der Gesellschaftssteuer für die beschlossene Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln sei § 2 Z 1 KVG gewesen. Diese Rechtsgrundlage besteuere den Erwerb von Gesellschaftsrechten an einer inländischen Kapitalgesellschaft durch den ersten Erwerber. Gegen diese Vorgangsweise bestünden einerseits verfassungsrechtliche Bedenken infolge Verletzung des Gleichheitsgrundsatzes, weil im Gegensatz zur vorliegenden Sach- und Rechtslage die Erhöhung der Kommanditanteile bei einer GmbH & CoKG (KEG) keinen Erwerb von Gesellschaftsrechten durch den ersten Erwerber darstelle, und somit nicht unter § 2 Z 1 KVG subsumiert werde (vgl. VwGH 26.3.1981, 15/3153/80). Andererseits bestünden gegen die Vorschreibung der Gesellschaftsteuer für die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln im allgemeinen gemeinschaftsrechtliche Bedenken, weil dieser Steuertatbestand dem Art. 4 Abs. 1 lit c KapAnsRL widerspreche. Mit dem gegenständlichen Bescheid wurde der Antrag auf Erstattung der selbst berechneten Gesellschaftsteuer abgewiesen im Wesentlichen mit der Begründung, die vom Notar vorgenommene Selbstberechnung entspreche dem Gesetz und sei daher zu Recht abgeführt worden. Erhöhe eine GmbH ihr Stammkapital aus Gesellschaftsmitteln, so unterliege diese (nominelle) Kapitalerhöhung gemäß
 § 2 Z 1 KVG der Gesellschaftsteuer. Bemessungsgrundlage sei der Nennbetrag der Anteilsrechte. Die gegen diesen Abweisungsbescheid erhobene Berufung stützt sich auf das ausschließliche Argument, gegen die Vorschreibung der Gesellschaftsteuer für die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln bestünden gemeinschaftsrechtliche Bedenken, weil dieser Steuertatbestand dem Art. 4 Abs. 1 lit. d (gemeint war lt. Schreiben vom 21. März 2005 die lit. c) KapAnsRL widerspreche. In diesem Zusammenhang werde auf das Erkenntnis des VwGH 6.11.2002, 2002/16/0240 verwiesen. Die abweisende Berufungsvorentscheidung stützte sich -ohne hiebei auf das Berufungsvorbringen konkret einzugehen- auf folgende Begründung: "Gemäß
 § 2 Z 1 KVG unterliegt der Gesellschaftsteuer der Erwerb von Gesellschaftsrechten an einer inländischen Kapitalgesellschaft durch den ersten Erwerber. In der Generalversammlung v.22.01.2003 wurde beschlossen das Stammkapital von € 36.336,41 um € 763.663,59 auf € 800.000,- zu erhöhen, wobei ein Betrag von € 190.915,90 auf F.F., € 420.014,97 auf H.F. und € 152.732,72 auf F.J.F. entfällt. Dies stellt eindeutig ein Ersterwerb von Gesellschaftsrechten dar.
 Daraufhin stellte die Bw. den Antrag auf Vorlage ihres Rechtsmittels zur Entscheidung durch die Abgabenbehörde zweiter Instanz. Zur Begründung wurde auf die Berufungsausführungen verwiesen. Über die Berufung wurde erwogen:
 Nach § 2 Z 1 KVG unterliegen der Gesellschaftsteuer der Erwerb von Gesellschaftsrechten an einer inländischen Kapitalgesellschaft durch den ersten Erwerber. § 8 KVG idF der Novelle BGBl. Nr. 629/1994 lautet: "Die Steuer beträgt 1 % der Bemessungsgrundlage". Mit dieser Bestimmung wurde eine Anpassung an das Gemeinschaftsrecht vorgenommen (vgl. dazu 1713 Seite 13 Blg zd StenProt. des NR XVIII GP). Die selbst berechnete Gesellschaftsteuer wurde ausschließlich mit dem Vorbringen bekämpft, gegen die "Vorschreibung" der Gesellschaftsteuer für die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln würden gemeinschaftsrechtliche Bedenken bestehen, widerspreche doch dieser Steuertatbestand dem Artikel 4 Abs. 1 lit c KapAnsRL. Im vorliegenden Berufungsfall besteht somit kein Streit darüber, dass eine Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln den Tatbestand des Ersterwerbes von Gesellschaftsrechten gemäß
 § 2 Z 1 KVG erfüllt (siehe diesbezüglich Dorazil, KVG- Kurzkommentar2, Seite 56, Rn 2 zu § 2 und Seite 63, Rn. 12.1 zu § 2 und Saurer, Gesellschaftsteuer bei Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln in ecolex 1993, Seite 409). Diesbezüglich wird weiters auf das Bundesgesetz über steuerliche Maßnahmen bei der Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln vom 6. Juli 1966, BGBl. 157/1966 idF der Nov. 416/1979 (steuerliches KapBG) verwiesen, worin im § 1 Abs. 1 der Fall der Erhöhung des Stammkapitals einer Gesellschaft mit beschränkter Haftung ausschließlich aus Gesellschaftsmitteln dergestalt geregelt wird, dass dies als Erwerb neuer Anteilsrechte angesehen wird und enthält dieses Gesetz in seinem § 2 ("Gesellschaftsteuer") ausdrücklich folgende Vorschrift: "Beim Erwerb neuer Anteilsrechte im Sinne des § 1 wird die Gesellschaftsteuer vom Nennbetrag berechnet". Bei der Entscheidung des vorliegenden Berufungsfalles ist daher unter Beachtung der herrschenden Ansicht davon auszugehen, dass die in Frage stehende (nominelle) Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln als Erwerb neuer Anteilsrechte gemäß
 § 2 Z 1 KVG der 1 %igen Gesellschaftsteuer berechnet vom Nennbetrag unterliegt. Weiters blieb außer Streit, dass infolge Nichtvorliegens der Tatbestandsvoraussetzungen die Befreiungsbestimmungen gemäß
 § 6 Abs. 1 Z 2 lit b KVG nicht zum Tragen kamen. Unbedenklich ist daher bei dieser Entscheidung davon auszugehen, dass nach nationalem Recht die selbst berechnete Gesellschaftsteuer rechtmäßig erfolgt ist. Auf die von der Berufung aufgeworfene Frage eines allfälligen Konfliktes der vorgenommenen inländischen Besteuerung dieser Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln mit Art. 4 Abs. 1 lit. c der Richtlinie des Rates vom 17. Juli 1969 betreffend die indirekten Steuern auf die Ansammlung von Kapital (69/335/EWG, im Folgenden kurz: Kapitalansammlungs-RL) wird wie folgt eingegangen. Art. 4 Abs. 1 lit c der Kapitalansammlungs-RL lautet: "(1) Der Gesellschaftsteuer unterliegen die nachstehenden Vorgänge:
 c) die Erhöhung des Kapitals einer Kapitalgesellschaft durch Einlagen jeder Art;"
 Nach der Richtlinienbestimmung des Art. 4 Abs. 1lit c zählt die Erhöhung des Kapitals einer Kapitalgesellschaft durch Einlagen jeder Art zum steuerpflichtigen Grundgeschäft. Wie der EuGH 17.10.2002 Rs- C-339/99 Energie Steiermark Holding AG, Vorabentscheidungsersuchen des österreichischen VwGH, zu den gestellten Fragen betreffend Großmutterzuschuss, und betreffend mittelbare Leistungen im Wesentlichen ausgeführt hat, werden von dem Begriff Einlagen jeder Art auch finanzielle Beiträge von der Großmutter oder auch mittelbare Leistungen erfasst, wenn nach den Umständen des Einzelfalles bei wirtschaftlicher Betrachtungsweise die Kapitalgesellschaft der eigentliche Empfänger dieser Beiträge ist. Der Verwaltungsgerichtshof hat daraufhin unter Hinweis auf diesen Spruch des Gerichtshofes der Europäischen Gemeinschaft über die Beschwerde, die zu den entsprechenden Fragestellungen geführt hat, mit dem in der Berufung zitierten Erkenntnis 6.11.2002, 2002/16/0240 abgesprochen. Darin brachte der VwGH ebenfalls zum Ausdruck, dass die Beurteilung der in Rede stehenden Fragen nicht auf einer rein formalen Ebene, sondern auf Grund einer wirtschaftlichen Betrachtungsweise vorzunehmen ist. Ansonsten wurde vom Urteilstenor her mit diesem VwGH- Erkenntnis vorrangig über die Frage der Besteuerung des Großmutterzuschusses bzw. der Besteuerung von mittelbaren Leistungen durch Zahlungen an Tochtergesellschaften abgesprochen und war somit vom Sachverhalt her mit dem vorliegenden Streitfall nicht vergleichbar. Die Erhöhung des Stammkapitals erfolgt auf Grund folgender nationaler Bestimmungen: § 52 GmbH- Gesetz: "(1) Die Erhöhung des Stammkapitals setzt einen Beschluss auf Abänderung des Gesellschaftsvertrages voraus.
 (2) Zur Übernahme der neuen Stammeinlage können von der Gesellschaft die bisherigen Gesellschafter oder andere Personen zugelassen werden.
 (3) Mangels einer anderweitigen Festsetzung im Gesellschaftsvertrag oder Erhöhungsbeschlusse steht den bisherigen Gesellschaftern binnen vier Wochen vom Tage der Beschlussfassung an ein Vorrecht zur Übernahme der neuen Stammeinlage nach Verhältnis der bisherigen zu. (4) Die Übernahmeerklärung bedarf der Beurkundung durch einen Notariatsakt." Von der in §§ 52f GmbHG geregelten ordentlichen oder effektiven Kapitalerhöhung ist die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln zu unterscheiden. Bei einer (nominellen) Kapitalerhöhung, bei der die Erhöhung aus Gesellschaftsmitteln erfolgt, kommt es zu einer Umwandlung offener Rücklagen in Stammkapital. Die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln ist Gegenstand des Kapitalberichtigungsgesetzes 1967 (KapBG, BGBl. Nr. 171/1967, zuletzt novelliert durch das Euro- JustizbegleitgesetzG BGBl. I Nr.125/1998. Nach § 2 Abs. 1 KapBG beschließt über die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln die Generalversammlung mit der Mehrheit, die für die Beschlussfassung über eine Erhöhung der Stammeinlage nach Gesetz oder Gesellschaftsvertrag erforderlich ist. Gemäß
 § 2 Abs. 3 KapBG können nur in dem im Abs. 2 bezeichneten Jahresabschluss ausgewiesene offene Rücklagen einschließlich eines Gewinnvortrages umgewandelt werden, soweit ihnen nicht ein Verlust einschließlich eines Verlustvortrages gegenübersteht. Nach § 3 Abs. 3 KapBG ist mit der Eintragung des Beschlusses über die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln in das Firmenbuch das Nennkapital mit Rückwirkung gemäß
 § 2 Abs. 2 erhöht und diese Kapitalerhöhung durchgeführt. Bei der Eintragung ist anzugeben, dass es sich um eine Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln handelt. Gemäß
 § 3 Abs. 4 KapBG stehen die neuen Anteilsrechte den Gesellschaftern im Verhältnis ihrer Anteile am bisherigen Nennkapital kraft Gesetzes zu; ein entgegenstehender Beschluss ist nichtig. Nach Artikel 4 Abs.1 lit c der Kapitalansammlungs-RL unterliegen der Gesellschaftsteuer die Erhöhung des Kapitals einer Kapitalgesellschaft durch Einlagen. Ausgehend von der gegebenen Sachlage, bei der nach dem Willen der Gesellschafter die Kapitalerhöhung aus der freien Rücklage bzw. aus dem Gewinnvortrag "finanziert" werden sollte, besteht aber in wirtschaftlicher Betrachtungsweise bezogen auf den angeführten Grundtatbestand (Kapitalerhöhung) kein entscheidender Unterschied, ob die drei Gesellschafter in einer zweistufigen Vorgangsweise in der Generalversammlung einen entsprechenden Gewinnausschüttungsbeschluss und in weiterer Folge einen Gesellschafterbeschluss im Sinne des § 52 GmbHG auf Abänderung des Gesellschaftsvertrages zur Erhöhung des Stammkapitals unter Übernahme der neuen Stammeinlagen nach dem Verhältnis der bisherigen fassen oder in einer einstufigen Vorgangsweise die Gesellschafter in der Generalversammlung die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln beschließen (§ 2 KapBG iVm § 3 Abs. 4 KapBG). Wirtschaftlich gesehen kommt es nach den Umständen des Einzelfalles bei beiden Vorgangsweisen letztlich zu einer entsprechenden "Umwandlung" des Kontos "Gewinnvortrag" in das durch Gesellschafterbeschluss festgelegte höhere Stammkapital. Die mit der beschlossenen Erhöhung des Stammkapitals einhergehenden gesellschaftsrechtlichen Wirkungen (z.B. § 82 GmbHG) bleiben bei beiden besprochenen Varianten der Erhöhung des Stammkapitals gleich. Die Erhöhung des Kapitals einer Kapitalgesellschaft aus Gesellschaftsmitteln kommt in wirtschaftlicher Betrachtungsweise in gleicher Weise der Kapitalgesellschaft durch ein nominell erhöhtes Stammkapital zugute wie dies bei der gegebenen Sachlage durch eine vorherige Gewinnausschüttung und beschlossener Erhöhung des Stammkapitals eingetreten wäre. Dem durch die gegenständliche Erhöhung des Stammkapitals aus Gesellschaftsmitteln verwirklichten Steuertatbestand nach § 2 Z 1 KVG steht daher nicht der Art. 4 Abs. 1 lit c Kapitalansammlungs-RL entgegen, wird doch in wirtschaftlicher Sicht dieser Grundstatbestand der Kapitalansammlungs-RL durchaus erfüllt. Das auf Art. 4 Abs. 1 lit c der Kapitalansammlungs-RL gestützte Berufungsvorbringen vermag den eingewendeten Widerspruch zwischen der Besteuerung der Erhöhung des Stammkapitals aus Gesellschaftsmitteln mit gemeinschaftsrechtlichen Bestimmungen nicht aufzuzeigen. Der behauptete Widerspruch mit Gemeinschaftsrecht besteht aber schon deshalb nicht, wird doch durch Art. 4 Abs. 2 lit a der Kapitalansammlungs-RL Folgendes normiert: "(2) Soweit sie am 1. Juli 1984 der Steuer zum Satz von 1 v. H. unterlagen, können die folgenden Vorgänge auch weiterhin der Gesellschaftsteuer unterworfen werden:
 a) die Erhöhung des Kapitals einer Kapitalgesellschaft durch Umwandlung von Gewinn, Rücklagen oder Rückstellungen;"
 Durch diese Richtlinienbestimmung wird somit ausdrücklich gemeinschaftsrechtlich festgehalten, dass die in Frage stehende Erhöhung des Stammkapitals einer GmbH durch Umwandlung von Gesellschaftsmitteln (Gewinnvortrag, Rücklagen) in Stammkapital "weiterhin der 1 % Gesellschaftsteuer unterworfen werden kann". Der unbestrittenermaßen durch die Kapitalerhöhung aus Gesellschaftsmitteln erfolgten Verwirklichung des Steuertatbestandes nach § 2 Z 1 KVG stehen daher nicht die Bestimmungen der Kapitalansammlungs-RL. entgegen, im Gegenteil in Art. 4 Abs. 2 lit a der Kapitalansammlungs-RL. wird dieser Umwandlungstatbestand als zulässiger Steuertatbestand der Gesellschaftsteuer ausdrücklich genannt. Im Berufungsfall liegt somit ein Konflikt weder zwischen dem Gemeinschaftsrecht und dem KVG noch zu der Rechtsprechung des EuGH vor. Aus diesem Grund bestand keine Veranlassung zu einer etwaigen Antragstellung an den EuGH zum Zweck einer Vorabentscheidung. Liegt der in der Berufung erhobene Vorwurf einer Verletzung des Gemeinschaftsrechtes nicht vor, sprechen keine Umstände gegen die Verwirklichung des Steuertatbestandes gemäß
 § 2 Z 1 KVG und gegen das Entstehen der Steuerschuld. Der auf die Bestimmung des § 10a Abs. 7 KVG gestützte Antrag auf Erstattung der selbst berechneten Gesellschaftsteuer wurde daher vom Finanzamt mit dem gegenständlichen Bescheid vom 3. Dezember 2003 zu Recht abgewiesen. Es war folglich wie im Spruch ausgeführt zu entscheiden. Innsbruck, am 31. März 2005 nach oben


text:
 Anunţ juridic important
 |
 22003D0018
 Decizia nr. 18/2003 a Comitetului mixt al SEE din 31 ianuarie 2003 de modificare a Protocolului 31 la Acordul SEE privind cooperarea în domenii specifice în afara celor patru libertăți
 Jurnalul Oficial L 094 , 10/04/2003 p. 0078 - 0079 ediţie specială în limba cehă: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 ediţie specială în limba estonă: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 ediţie specială în limba maghiară capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 ediţie specială în limba lituaniană: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 editie speciala in limba letona: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 editie speciala in limba malteza: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 editie speciala in limba poloneza: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 editie speciala in limba slovaca: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 ediţie specială în limba slovenă: capitol 11 volum 08 p. 83 - 84 ediţie specială în limba bulgară: capitol 11 volum 62 p. 179 - 180 editie speciala in limba româna: capitol 11 volum 62 p. 179 - 180
 Decizia nr. 18/2003 a Comitetului mixt al SEEdin 31 ianuarie 2003de modificare a Protocolului 31 la Acordul SEE privind cooperarea în domenii specifice în afara celor patru libertățiCOMITETUL MIXT AL SEE,având în vedere Acordul privind Spațiul Economic European, astfel cum a fost modificat prin Protocolul de adaptare a Acordului privind Spațiul Economic European, denumit în continuare "acordul", în special articolele 86 și 98,întrucât:(1) Protocolul 31 la acord a fost modificat prin Decizia nr. 70/1999 a Comitetului mixt al SEE din 2 iunie 1999 [1].(2) Este necesară extinderea cooperării dintre părțile contractante la acord în scopul includerii Deciziei nr. 1145/2002/CE a Parlamentului European și a Consiliului din 10 iunie 2002 privind măsurile comunitare de stimulare în domeniul ocupării forței de muncă [2].(3) Protocolul 31 la acord ar trebui modificat în consecință pentru ca această cooperare extinsă să poată fi realizată începând cu 1 ianuarie 2003,DECIDE:Articolul 1Textul articolului 15 din Protocolul 31 la acord se modifică după cum urmează:1. Textul de la alineatul (5) se înlocuiește cu următorul text:"Statele AELS participă la activitățile comunitare menționate la alineatul (8) prima liniuță începând cu 1 ianuarie 1999 și la activitățile menționate la a doua liniuță începând cu 1 ianuarie 2003."2. Cuvântul "act" de la alineatul (8) se înlocuiește cu cuvântul "acte".3. La alineatul (8) se adaugă următoarea liniuță:- "— 32002 D 1145: Decizia nr. 1145/2002/CE a Parlamentului European și a Consiliului din 10 iunie 2002 privind măsurile comunitare de stimulare în domeniul ocupării forței de muncă (JO L 170, 29.6.2002, p. 1)."Articolul 2Prezenta decizie intră în vigoare la data de 1 februarie 2003 cu condiția să se fi efectuat toate notificările prevăzute la articolul 103 alineatul (1) din acord către Comitetul mixt al SEE [***].Prezenta decizie se aplică de la 1 ianuarie 2003.Articolul 3Prezenta decizie se publică în secțiunea SEE și în suplimentul SEE ale Jurnalului Oficial al Uniunii Europene.Adoptată la Bruxelles, 31 ianuarie 2003.Pentru Comitetul mixt al SEEPreședinteleP. Westerlund[1] JO L 284, 9.11.2000, p. 57.[2] JO L 170, 29.6.2002, p. 1.[***] Nu au fost semnalate obligații constituționale.--------------------------------------------------